编者: 赵  燕

主审: 张学文

 

 

基因工程是现代生物技术的核心，也是现代分子生物学研究的重要手段。掌握基因工程技术对于生物技术专业及其它生物学相关专业学生都很重要。

基因工程本身是由一系列分子生物学操作技术组成的系统性技术体系，本实验指导侧重于DNA重组操作，将基因工程操作的常用和核心技术组织起来，以为我校生物技术本科生及有关专业研究生基因工程实验提供简单而明确的指导。

为适应基因工程的飞速发展，一些生物技术公司匠心独运，开发出专门的试剂盒，使一些复杂的实验操作简单化了。这对于实验者来说自然是好事，但也使实验者动手胜于用脑。对于实验人员来说，一定应知其然并知其所以然，才会在实验中运用自己的知识予以创新性的发展。期望本实验指导不成为实验中的教条。

 

编  者

2007年4月

 

 

 

  大肠杆菌(Escherichia coli)是分子遗传学实验、基因工程操作中广泛采用的一种受体菌，它的遗传背景研究的比较详细，常用做寄主进行基因扩增及外源基因的表达。

一.  实验目的: 掌握大肠杆菌的对照培养、单菌落的分离及菌种保存方法。

 

二.  实验原理: 大肠杆菌除本身的核染色体外，往往还含有质粒(Plasmid)DNA，这是一种双链闭合环状的DNA分子，大小在1Kb-200Kb左右，通常质粒DNA带有利于细菌在某一特定环境下生存的酶的基因，而使寄主菌表现以下一些表现型:

 1．对抗生素的抗性      2．产生抗生素           3．降解有机复合物

 4．产生大肠杆菌素      5．产生内毒素           6．产生限制修饰酶

  pUC19质粒上带有一个与大肠杆菌抗氨苄青霉素(Ampecillin)有关的基因，它能编码一种β-内酰胺酶，这种酶降解氨苄青霉素，从而消除了抗生素对细胞壁形成的抑制作用，不含这种质粒的细菌则不能在含抗生素的培养基上存活。

 

三．实验材料:　E．coli InvaF^'    E．coli InvaF^'(pUC19)

 

  仪器:超净工作台   恒温培养箱    高压灭菌锅     恒温水浴锅    微波炉等

  器皿:(见附录)

  试剂:琼脂    酵母抽提物    胰蛋白胨    Nacl   氨苄青霉素    NaOH等

 

1.      配制培养基：

ａ．LB(Lurib-Bertani) media

酵母抽提物   (Yeast extract)    5g/L

胰蛋白胨     (trytone)        10g/L

        Nacl                        10g/L

加蒸馏水定容至1000ml调节pH值至7.0。

配制750ml固体培养基: 在上述液体培养基中，按15 g/L加入琼脂加热至充分熔化，即成固体培养基。

ｂ：50%的丙三醇: 取50ml丙三醇加入50mlddH₂O至100ml。

将上述培养基和丙三醇溶液高温蒸汽消毒15磅20min

2.      倒平板:将固体培养基加热至充分熔化，待温度降至50℃以下凝固前，加入Amp至100ug/ml摇动混匀，每平皿倒入25ml左右，此过程应进行无菌操作，另倒一不含Amp的LB平板。

3.      待培养基凝固以后，用接种环(灼烧消毒后)分别接种各一环贮存菌种:E.coli InvaF^'  和  E.coli InvaF^'(pUC19)于不含Amp的LB平板上和含Amp的LB平板上,划线接种要防止划破培养基，划线方法如图所示:

 

 

 

 

 

 

 

 

第一次划线后接种环灼烧   第二次划线起点与第一次　　      如此在平板上

再进行第二次划线       　 划线交*，接种环灼烧后再        划线5-6次

                      进行第三次划线

 

4.      接种完成后将培养皿倒置入培养箱37℃培养过夜，运用这种划线方法接种，可以较好地保证单菌落的形成。

5.      比较两菌系在培养基上的不同反应。挑取:E.coli InvaF^'E.coli InvaF^'(pUC19)的单菌落分别接种至含Amp和不含Amp的5ml LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。

6.      分别吸取0．5 ml菌液在无菌条件下，加入0．5 ml 50%丙三醇，置一灭菌的冻干管中，混匀至-20℃保存。

1.    平板培养细菌为什么要倒置培养?

2.      细菌的继代繁殖为何要强调单菌落分离?

3.      在固体培养基中怎样加入抗生素?

4.      简述单菌落分离的接种过程。

 

一．实验目的:了解基因工程操作中运载基因的载体，掌握最常用的提取质粒DNA的方法。

 

二．实验原理: 碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。利用溶菌酶、强碱(NaOH)及表面活性剂(SDS)使细胞破壁、膜，释放出胞内染色体DNA，质粒DNA及其它物质，通过一系列的纯化过程:高盐除核DNA，苯酚-氯仿抽提变性蛋白和脂类，最后用异丙醇(或乙醇)沉淀出质粒DNA和RNA等， RNA再经RNase消化，得到质粒DNA，这种质粒DNA可用作基因工程的载体，更广泛地用于重组子的鉴定。

三.  实验材料: Ecoli InvaF^'(pUC19)

 

   仪器、器皿(见附录)

   试剂:1．溶液1(GTE)     50 mmol/l       葡萄糖

10 mmol/l        EDTA-Na₂

25 mmol/l        Tris-Cl  (pH 8.0)

4mg/ml           溶菌酶

        2．溶液2    200 mmol/l       NaOH

1% SDS

        3．溶液3    5 mol/l KAC    60 ml

冰乙酸        11．5ml

ddH₂O         28．5ml

4．苯酚-氯仿

5.      异丙醇(或95%乙醇，100%乙醇)

6.      70%乙醇

7.      TE (pH 8.0):   10 mmol/l   Tris-Cl  (pH 8.0)

                 1 mmol/l    EDTA-Na₂

8．RNase  1mg/ml        Amp   100ug/ml

 

1.    挑取一单菌落的Ecoli InvaF^'(pUC19)菌种接种到含Amp100ug/ml的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。

2.      吸1．4ml菌液至eppendorf管中，在高速台式离心机上5，000g离心2min，倒去培养基。

3.      重复1次，尽可能倒出培养基并将管倒置于纸帕上，以吸干管壁上残留的培养基，收集细菌。

4.      将细菌悬于500ul冰冷的溶液1中，于离心机上5，000g离心2min。

5.      倒去溶液1，再悬于200ul冰冷的溶液1中。

6.      加入300 ul新配制的溶液2，冰浴5 min。

7.      加入300ul冰冷的溶液3，中和，轻轻振荡10sec，至冰浴5 min。

8.      于离心机上，10，000 g离心5min。

9.      取上清转移至一新管中，并加入RNase酶至50ug/ml，于37℃水浴中温浴30 min。

10.  加入等体积的饱和酚抽提1次，10，000 g离心5min取上清液。

11.  再加入等体积的氯仿抽提1次， 10，000 g离心5min取上清液。

12.  加入750ul异丙醇，沉淀质粒DNA， 10，000 g离心10min。

13.  倒去异丙醇，用70%乙醇洗涤沉淀，10，000 g离心5min。

14.  置冰箱内开盖干燥，悬浮至40ul去离子水或TE中。

 

1.    有机溶剂抽提为什么可以达到除蛋白，脂类杂质的目的?

2.      异丙醇沉淀DNA后为什么要经过70%乙醇清洗这一步?

3.      逐步说明强碱法提取质粒DNA的原理。

 

 

 

 

 

 

 

  学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳技术，检测DNA的纯度，DNA的构型，含量以及分子量的大小。

 

  琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，它具有亲水性且不含带电荷的基团，是一种很好的电泳支持物，DNA分子在碱性环境中带负电荷，在电场作用下向正极泳动，不同的DNA片段由于电荷、分子大小及构型不同，在电场中所受的动力及琼脂糖交联分子的阻力不同，小分子及构型紧密的分子泳动较快，大分子则较慢，大小相同的分子形成一条带，于是达到了分离DNA分子的目的。

 

三．实验材料: 菌种 Ecoli．INVαF^，(pUC19)

 

   仪器、器皿(见附录)

   试剂:1．电泳缓冲液: 5×TBE pH8．0(使用浓度为0．5×)

        配制:称取54．0gTris，27．5g硼酸，加入20ml 500mmol/l的EDTA，先加800ml重蒸水，加热溶解后，再加重蒸水定容至1000ml。

2．1mg/ml溴化乙锭溶液 (EB)

        配制:带手套谨慎称取1mg溴化乙锭，溶于1ml重蒸水中，置4℃冰箱备用。(EB是DNA的诱变剂，亦是强致癌屋，操作时应小心!)

3．琼脂糖:视实验要求制不同浓度的胶，用0．5×TBE作溶剂配制。

        4．0．2% 溴酚蓝，50%蔗糖指示剂(Loading buffer)

          配制: 称取溴酚蓝100mg，加重蒸水5ml，在室温下过夜，待溶解后再称蔗糖25g，加重蒸水溶解后移入溴酚蓝溶液中，摇匀后加重蒸水定容至50ml，加NaOH1-2滴调至蓝色。

 

1.      琼脂糖凝胶的制备: 琼脂糖凝胶的浓度一般为0．5%-1．5%， 称取1g琼脂糖于250ml的三角瓶中，加入100ml 0．5×TBE于微波炉内充分加热煮沸，慢慢冷却至50℃以下，电泳平板洗净后晾干，两端封上胶布，置于水平板上，架上梳子后倒入凝胶液4-5mm厚，待凝胶充分凝固后，撕下两端胶布，置于电泳槽内，加入电泳缓冲液至浸没胶0．5mm左右，轻轻拔出梳子，接上电源，明确电源极性。

2.      样品准备:电泳样品DNA的量由电泳所跑的带的数量而定，一般为2-800ng，质粒DNA一般为两条带，这是由同种分子构型差异而形成的，点样量为300ng左右。

          吸取质粒DNA    pUC19 12ul

          TE或重蒸水           4ul

          Loading buffer          4ul

3.      点样

4.      开稳压电源，电压调整至1-5V/cm，电泳3-4小时。

5.      染色: 电泳后的凝胶，置于含溴化乙锭0．5ug/ml(EB)的蒸馏水或TBE染色0．5h，为方便起见，常在电泳时在电泳液中加EB或直接在凝胶中加入EB。

6.      观察电泳结果:将凝胶置于透射式紫外检测仪上，在紫外灯下可见荧光带。

7.      绘出电泳带草图。

 

1.      简述DNA分子大下电泳确定法。

2.      凝胶电泳为什么能分离不同构型或分子大小DNA?

3.      你认为迁移率与分子大小是否成直线关系。

 

 

 

 

 

 

 

植物DNA是进行分子遗传研究的基本对象，提取完整，高纯度的DNA是研究中很重要的一环，在近年来兴起的分子育种中运用尤为广泛，掌握植物DNA的提取方法，了解其原理有其重要意义，本实验在着重于原理的前提下，介绍一种可适用于多种植物的简便方法。

 

一．实验目的:学习植物总DNA的提取、纯化及检测方法

 

二．实验原理:植物DNA的提取首先是机械破碎植物细胞，可采用石英砂或氧化铝研磨法，液氮冷冻研磨法等，在研磨液中含有SDS破细胞膜，蛋白酶水解除DNA结合蛋白，再以有机溶剂除去蛋白、脂类和杂质，乙醇沉淀DNA，这时的DNA为粗制品，含RNA、少量蛋白质、多糖等杂质，经RNase处理再以有机溶剂抽提和乙醇沉淀，可得到较纯的DNA适用于一般的分子育种工作。

 

 

   仪器、器皿(见附录)

   试剂: 研磨液:  0.45mol/l  NaCl

                 0.1 mol/l   Tris-Cl  (pH7.0)

                 0.1mol/l    EDTA-Na₂

                      1% SDS

         70%乙醇   95%乙醇

         氯仿-异戊醇 (24:1) 

         5mol/l  高氯酸钠

         3mol/l  NaAC

         TE:   10mmol/lTris-Cl (pH7.6)

1mmol/l EDTA--Na₂ (pH 7.6)

         RNase:  10mg/ml

 

1.       称取植物材料10g，野外采材要经清洗，再以70%乙醇表面消毒后凉干。

2.       将材料置于研钵中，倒入适量液氮捣碎材料并研磨至粉状。

3.       加入20ml研磨液，继续研磨至糊状。

4.       加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)充分混匀，分装于离心管中，平衡。

5.       离心除渣，4，000g 10min，将上清移至一新管。

6.       72℃水浴保温3-4min，加入5mol/l的高氯酸钠(体积比为4:1)

7.       加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)充分混匀，4，000g离心10min。

8.       加入2倍体积的95%低温乙醇，沉淀DNA，可见白色丝状物。

9.       用玻棒搅起丝状物(搅不起的，可离心收集沉淀物)，用适量TE溶解。

10.   加RNase至终浓度为50ug/ml，37℃保温30min。

11.   加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)， 4，000g离心10min。

12.   吸取上层水相，加入1/10体积的3mol/l NaAC及2倍体积经预冷的95%乙醇，混匀，在-20℃放置30min，DNA形成纤维状沉淀。

13.   沉淀加入1ml70%乙醇洗涤1次，4，000g离心8min去上清，纸帕吸干。

14.   DNA沉淀真空干燥后溶于TE中。

15.   将DNA粗制品和纯化品点样电泳，设DNA分子量标准，观察DNA纯度，分子大小。

16.   对纯化后DNA样品进行紫外吸收测定，计算DNA浓度和纯度，用坐标纸绘出DNA吸收曲线。

附: DNA纯度鉴定公式:

A_260nm/A_230nm≥1.8

A_260nm/A_280nm≥1.8

DNA浓度(ug/ml)=A_260nm×50稀释倍数

 

1.     研磨液中EDTA的作用是什么?

2.     沉淀粗DNA时不要加NaAc，而纯化后再沉淀时则要加入NaAc，为什么?

 

 

 

 

 

 

聚合酶链式反应（polymerease chain reaction， PCR）即在DNA聚合酶催化下，通过引物延伸核酸的某个区域而进行的重复双向DNA合成。扩增反应一般包括DNA模板变性、引物与模板退火、引物延伸合成三步反应的重复过程。经过多次循环，使一个模板分子的特定区域得以等比级数地扩增。耐热DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶）的应用，使聚合酶能耐受DNA变性的高温，因而避免了每次热变性后聚合酶失活，使扩增的三步反应实现了连续的循环，在此基础上产生了自动PCR仪。

PCR扩增的产物是由两引物界定的一段双链DNA。通常的PCR引物是一段人工合成的寡核苷酸，在反应体系中成对存在，与DNA模板一定区域的两条链分别互补。在DNA模板变性后的退火过程中，两引物与模板上的互补序列发生退火复性，为DNA的合成提供了带3'-OH的引物序列，在聚合酶的催化下便可进行引物延伸合成DNA。

PCR反应的原理可由下图所示：

了解PCR的基本原理；

掌握PCR实验的操作方法；

运用PCR方法检验克隆质粒。

 

寡核苷酸引物，为pUC质粒的通用引物，正向为：GTAAAACGACGGCCAGT；反向为：CAGGAAACAGCTATGAC。两引物的互补序列位于pUC质粒多克隆位点的两端，因此可将克隆在多克隆位点的插入片段扩增出来。

Taq DNA 聚合酶及其最适缓冲液（10X）

15mM MgCl₂

2mM dNTPs（pH 7.0）

去离子水

PCR薄壁管

PCR仪

琼脂糖凝胶电泳装置

凝胶成像系统

 

 

按以下比例和浓度在PCR反应管中按下列顺序配制反应体系：

去离子水                           11ul

10X Taq DNA 聚合酶 缓冲液          2ul

质粒DNA模板                      1ul

正向引物                            1ul（25p mol）

反向引物                            1ul（25p mol）

dNTPs                              1ul

MgCl₂                                  2ul

Taq DNA 聚合酶                     1ul（1 U）

总体积20ul，混匀后置于PCR仪中进行自动PCR

 

②PCR仪的设置：

预变性 95℃  4 min

变性   94℃  1min

退火   52℃  1min          循环35次

延伸  72℃  1min

最后延伸 72℃  5 min

 

③电泳检查：

扩增结束后，在体系中直接加入4ul电泳载样缓冲液，在预加了EtBr的1.0%琼脂糖凝胶上点样电泳（见实验4）。5V/cm电场强度电泳45min后，紫外线下观察凝胶，正确扩增反应可观察到目的分子带。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

真核生物的RNA包括rRNA、tRNA和mRNA。一个典型的真核细胞约含有10^-5~10^-6mg的RNA，其中80-85%为rRNA，其余15-20%主要由各种低分子量RNA组成（如tRNA、核内小分子RNA等），细胞的RNA大多都与蛋白质结合在一起，但这种结合很容易在变性剂存在下打破。在经有机溶剂抽提后，用乙醇或异丙醇可将其从上清中沉淀出来。

RNA提取中要严格避免RNA酶的污染，因为RNA酶极稳定，通常的消毒方法难以将其灭活，而空气中细菌、真菌和操作者都有可能成为RNA酶的污染源。RNA酶污染会使分离的RNA大量降解。

对于rRNA和tRNA分子具有确定的大小和核苷酸序列，当总RNA分离出来后还能用电泳、密度梯度离心、层析等方法加以进一步分离纯化。而mRNA的分离将在后续实验中做到。

 

       认识真核生物RNA的组成及分离的原理；

       学习RNA提取过程中抑制RNA酶活性的方法；

      

       水稻幼苗，剪取幼芽。

 

       瓷研钵（组织捣碎机）、eppendorf离心管、冷冻台式离心机、液态氮、剪刀、一次性手套、恒温水浴锅、真空干燥仪、紫外分光光度计、凝胶电泳装置、凝胶成像系统等。

       进行RNA提出的所有器皿必须保证未受RNA酶的污染，玻璃、瓷器和金属耐热器皿应先以0.1%DEPC（二乙基焦碳酸盐）水溶液浸泡2hr，然后以铝箔包裹后在180℃烘烤过夜。使用新的塑料制品，并将其在0.1%DEPC中浸泡2hr并经高压蒸汽消毒30min。操作过程中还应严格避免外源RNA酶的污染。

       药品：异硫氰酸胍、CSB（柠檬酸/十二烷基肌氨酸钠/b-巯基乙醇）缓冲液、2mol/L NaAc pH 4.0、酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）、异丙醇、75%乙醇、DEPC H₂O等。

 

1．称取材料0.1g，剪成约2mm长段，加入液氮研磨成细粉状。

2．加入0.2g异硫氰酸胍和2ml CSB缓冲液，继续研磨成匀浆。

3．将匀浆转移至两个eppendorf管中，加入0.12ml NaAc，加盖后反复颠倒离心管20次。

4．每管加入1ml酚：氯仿：异戊醇，混匀后剧烈震动10sec，冰浴15min。

5．10，000g，4℃离心15min。

6．小心将上层水相转移至新管中，注意不要吸动中间层。中间层富含蛋白质和DNA。

7．加入等体积的异丙醇，混匀后置-20℃放置30min以沉淀RNA。

8.10，000g，4℃离心20min沉淀RNA。

9.弃上清，将RNA沉淀悬浮到0.5ml CSB溶液中，摇动溶液至RNA溶解。

10.加入等体积的酚:氯仿:异戊醇重新抽提一次，即重复④—⑧的步骤。

11．离心后弃上清，沉淀用0.5ml预冷的75%乙醇漂洗一次。离心后弃上清，真空初步干燥沉淀。

12．RNA溶解在0.2ml  DEPC水中，用紫外分光光度计测定260nm、280nm、及230nm波长的光密度，获得RNA的浓度和纯度。

 

注：1.RNA的浓度C=A₂₆₀×40×测定稀释倍数（ug/ml），

纯RNA的A₂₆₀/A₂₈₀比值在1.7-2.0之间，若低于该值范围，表明有蛋白质污染，应重新进行有机溶剂抽提。若高于该范围，可能有异硫氰酸胍的残留或有核酸的严重降解，应重新进行醇沉淀的步骤。

2．当前有很多生物技术公司生产分离RNA的试剂盒，如Trizol试剂，将异硫氰酸胍、CSB及苯酚混合在一起，按一定的体积与材料研磨后，即可通过氯仿抽提和乙醇沉淀RNA，可很方便地进行RNA的分离。

 

 

 

 

RT-PCR即逆转录PCR，过程由两部分组成：cDNA的合成：以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下，以Oligo（dT）或特异的下游引物合成与mRNA为互补的cDNA片段；PCR扩增：以已合成的cDNA为模板，在耐热的DNA聚合酶和上、下游引物作用下进行标准的PCR扩增。

PCR和RT-PCR技术操作简单，敏感性高，已广泛应用于基因结构分析、基因表达和基因克隆研究。

 

1．模板RNA：根据实验二（哺乳动物细胞RNA的分离）的方法，提取总RNA，适当稀释后备用。

2．四种脱氧核苷三磷酸（dNTPs，包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP）：用pH7.0的中性水溶液先分别配成100mmol/L储备液，储存于-20℃。使用时，取dATP、dCTP、dGTP、dTTP贮备液等分混匀，并适当稀释，使dNTPs工作液的浓度为10mmol/L。

3．标准PCR缓冲液：10×缓冲液组成为：200mmol/L Tris-HCl (pH8.3，25℃)，15mmol/LMgCl₂，250mmol/LKCl，0.5%Tween20，1mg/mlBSA(或gelatin)。

4．引物

 （1）Oligo(dT)₁₆，合成后用水溶解，使其浓度为500ng/ul。（2）PCR扩增引物

本实验所用引物根据-actin mRNA的序列设计，扩增产物的长度为260bp。上游引物：5^’-TGACGGTCAGGTCATCACTATCGGCAATGA-3’下游引物：5’-TTGATCTTCATGGTGATAGGAGCGAGGGCA-3’。引物合成后用水溶解，配制成100umol/L贮备液，使用时稀释成10umol/L或2umol/L。

5．TaqDNA聚合酶：浓度为3U/ul，为了便于准确取样，实验前稀释成1。5U/ul（也可以不稀释）。

6．AMV逆转录酶，缓冲液。

7．DEPC处理的无菌双蒸水。

 

cDNA的合成

总RNA ≤1ug（约5—10ul）

Oligo(dT)₁₆   0.5ug（也可使用特异下游引物50—100pmol）

RNasin            20U

5xRT缓冲液        4ul

10mmol/LdNTPs     1ul

AMV逆转录酶      10ul

加水到             20ul

42℃保温30—60分钟，冰上冷却，离心数秒钟，然后进行PCR。

PCR

5ml反应管中，按照以下顺序加入各种成分，使反应总体积为50μl:

   H2O                    28μl

   10×PCR缓冲液          5μl

   10×dNTPs（2.0mmol/L）  5μl

   扩增引物混合物（2μmol/L） 5μl

cDNA模板                5μl

TaqDNA聚合酶（1.5U）    2μl

在冰上轻轻混匀后，离心数秒钟，放置于冰上，准备上机扩增。

⒉上机

先在DNA扩增仪上设置好循环程序：94℃预变性2分钟；94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸40秒，共30个循环；72℃延伸5分钟。反应管放在DNA扩增仪的插孔中。按“START”键，循环开始。

⒊循环完毕，取出反应管，放置于4℃冰箱备用。

⒋ PCR产物电泳

PCR扩增完毕，需要用凝胶电泳的方法检测扩增效果。扩增片段长度一般在0.2kb～1.0kb，宜用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳，以φX174/HaeⅢ作为分子量标准。如扩增片段的长度在1.0kb～3.0kb范围，宜用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳，以λ/HindⅢ+EcoRⅠ作为分子量标准。

⑴1.5％琼脂糖凝胶的制备

   称取1.5g琼脂糖放于洁净的250ml三角烧瓶中，加100ml0.5×TBE，放入微波炉或水浴锅内，加热至琼脂糖完全溶化透明。取出冷却至55℃左右。加5μl10mg/ml溴乙锭于琼脂糖溶液中，混匀后倒胶。放置半小时以上。

    ⑵ 点样及电泳

将制备好的凝胶放入电泳槽中，加入适量0.5×TBE（缓冲液高于凝胶平面2mm），取出梳板。

   在PCR反应管中加等体积氯仿，混匀后，离心2分钟，吸出上层PCR产物于另一离心管中。取5μl 或10 μl PCR产物与上样缓冲液（50％甘油，10mmol/L EDTA，0.05％溴酚蓝，0.05％二甲苯蓝）混匀，加入到凝胶的点样孔中，左侧点φX174/HaeⅢ分子量标准（100ng），在100V稳压条件下电泳1～1.5小时。

  ⑶ 观察结果

将凝胶放置于紫外检测仪上观察。必要时可照相，记录实验结果。（主要分析：①是否有扩增产物。②如有拖尾或有几条区带，说明有非特异性扩增。③分子量标准电泳后区带是否分开。④与分子量标准比较，PCR产物的长度是否正确。⑤PCR产物的产量）。

 

为了防止皮肤上的RNase对样品RNA的降解以及脱落的细胞可能导致的假阳性结果，做RT-PCR反应时应戴手套，并洗去滑石粉，擦干净。

加入试剂的量一定要准确。

    

无PCR产物。可能由以下原因导致：

(1)无模板DNA。（2）无TaqDNA聚合酶：TaqDNA聚合酶无活性。（3）无引物或引物已降解。（4）变性温度和时间是否已使模板DNA解链。（5）PCR仪的热传递效率。（6）Mg²⁺浓度是否合适。

PCR产物呈拖尾现象。可通过下列方法解决：

提高退火温度。（2）减少Taq　DNA聚合酶的用量。（3）试用二步法进行PCR扩增。（4）调节Mg²⁺浓度，使之最优化。（5）减少延伸时间。（6）减少循环次数。（7）设计新的引物。（8）采用热启动法进行PCR。

引物二聚体。

（1） 防止引物3'端互补。（2）设计较长的引物。（3）增大模板的量。（4）降低引物的浓度。（5）减少循环的次数。（6）提高退火温度。

阴性对照（不加模板DNA）有扩增带，说明试剂已污染，可通过下述方法解决：

(1) 操作时带手套。（2）不要重复使用Tip，Eppendorf管。（3）重新配制有关试剂。（4）为防止交*感染，可在Eppendorf管中加入除模板DNA以外的其他试剂，充分混匀后，分到各管中，再加模板，滴石蜡油，进行PCR循环。该法在同时做多个样品时尤为适用，可省时省力。（5）用dUTP替代dTTP进行PCR扩增。实验前用脲嘧啶N糖苷酶（UNG）来清除上一次PCR产物中的dUTP，最终消除PCR 产物对反应试剂的污染。

 

 

 

 

（设计性、综合性实验）

1  实验目的

1.1  运用基因工程操作原理，学会体外重组分子的设计、构建、筛选及检测；

1.2  掌握DNA的酶切技术；

1.3  掌握DNA的回收与纯化技术；

1.4  掌握DNA的重组连接技术；

1.5  掌握细菌的转化技术；

1.6  掌握细菌的培养技术.

2   实验内容

2.1  载体的制备；          

2.2  外源插入片段的制备；  

2.3  电泳检测；           

2.4  DNA的回收与纯化；    

2.5  载体与插入片段连接；  

2.6  重组子的转化；        

2.7  重组子的筛选；         

2.8  重组子的检测、鉴定。   

3  实验考核要求

3.1  综合考核学生学习并运用所学理论与实践知识进行综合实验设计的能力；

3.2  综合考核学生对所学知识的拓展及实际运用能力；

3.3  综合考察学生实验操作技能及分析解决问题的能力。

 

 

（设计性、综合性实验）

 

1  实验目的

1.1  运用基因工程操作原理，学会植物表达载体的设计、构建、筛选及检测；

1.2  了解并掌握构建植物表达载体的必备元件；

1.3  掌握DNA的酶切技术；

1.4  掌握DNA的回收与纯化技术；

1.5  掌握DNA的重组连接技术；

1.6  掌握细菌的转化技术；

1.7  掌握细菌的培养技术.

2   实验内容

2.1  载体的制备；          

2.2  外源插入片段的制备；  

2.3  电泳检测；            

2.4  DNA的回收与纯化；    

2.5  载体与插入片段连接；  

2.6  重组子的转化；        

2.7  重组子的筛选；         

2.8  重组子的检测、鉴定；   

3  实验考核要求

3.1  综合考核学生学习并运用所学理论与实践知识进行综合实验设计的能力；

3.2  综合考核学生对所学知识的拓展及实际运用能力；

3.3  综合考察学生实验操作技能及分析解决问题的能力。

 

 

（设计性、综合性实验）

 

 

1  实验目的

1.1  了解植物遗传转化的方法；

1.2  学习并掌握根癌农杆菌介导的植物遗传转化方法；

1.3  了解并掌握叶盘转化法的整个过程及操作要领.

2   实验内容

2.1  转化载体系统的建立；（实验九已完成）

2.2  工程农杆菌的制备；

2.3  工程农杆菌对受体植物的转化；

2.4  后续的抗性筛选及转化植株的培养(结合细胞工程实验进行).

3  实验考核要求

3.1  综合考核学生学习并运用所学理论与实践知识进行综合实验设计的能力；

3.2  综合考核学生对所学知识的拓展及实际运用能力；

3.3  综合考察学生实验操作技能及分析解决问题的能力.

 

 

 

 

 

1.      超净工作台

2.      恒温培养箱  恒温水浴锅

3.      冷冻设备: 4℃  -20℃   -70℃冰箱

4.      灭菌设备: 高压蒸汽灭菌锅  电热恒温烘箱    0。22微米孔径滤膜过滤器

5.      离心机: 高速冷冻离心机   台式高速离心机   超速离心机

6.      真空干燥:  真空泵与恒温真空箱   真空泵与干胶器

7.      电泳设备: 稳压电泳仪   水平式电泳槽  垂直式电泳槽    DNA测序仪   全自动测序仪

8.      分光光度计

9.      紫外检测仪

10.  搅拌器: 加热搅拌器   振荡搅拌器    涡旋混合器

11.  PCR仪等

 

三角瓶:     150毫升                微量进样器     0-20微升

            250毫升                                0-200微升

            500毫升                                0-1000微升

烧杯:       100毫升                     搪瓷盘

            250毫升                     吸水纸

              500毫升                     羊皮纸

             1000毫升                     Whatman滤纸

量筒:          50毫升                     乳胶手套

100毫升                     塑料手套

250毫升                     镊子

500毫升                     剪刀

培养皿:          9厘米                    透析袋及透析袋夹子

试管:          10毫升                     硝酸纤维素滤膜

Eppendorf管及管架                         保鲜膜

Tip:               1毫升                    塑料铝箔

                200微升                    DEAE滤膜

塑料离心管:       40毫升                   接种环

                250毫升                    涂布棒等