实验一 植物体内可溶性糖含量的测定（蒽酮法）
一 、目的： 糖类物质是构成植物体的重要组成成分之一，也是新陈代谢的主要原料和贮存物质。不同载培条件，不同成熟度都可以影响水果、蔬菜中糖类的含量。因此对水果、蔬菜中可溶性糖的测定，可以了解和鉴定水果、蔬菜品质的高低。 二、原理 糖类遇浓硫酸脱水生成糖醛或其衍生物，反应如下： HO—CH—CH—OH CH—CH | | 浓H2SO4 || || H—CH CH—CHO CH C—CHO + 3H2O | | △ OH OH O 戊糖 糠醛 HO—CH—CH—OH CH—CH | | 浓H2SO4 || || HO—CH2—CH CH—CHO HO— CH2—C C—CHO + 3H2O | | △ OH OH O 已糖 羟甲基糠醛 糠醛或羟甲基糠醛进一步与蒽酮试剂缩合产生蓝绿色物质，其在可见光区620nm波长处有最大吸收，且其光吸收值在一定范围内与糖的含量成正比关系。 此法可用于单糖、寡糖和多糖的含量测定，并具有灵敏度高，简便快捷，适用于微量样品的测定等优点。 三、实验材料、仪器及试剂 1．材料：白菜叶、柑桔 2．仪器：分光光度计 恒温水箱 20ml具塞刻度试管（3支） 漏斗 100ml容量瓶 刻度试管 试管架 剪刀 研钵 3．试剂： （1）200μg/ml标准葡萄糖：AR级葡萄糖100mg，蒸馏水溶解，定容至500ml。 （2）蒽酮试剂：1g蒽酮，用乙酸乙酯溶解，定容至50ml，棕色瓶避光处贮藏； （3）浓硫酸 四、实验方法 1．葡萄糖标准曲线的制作 取6支20ml具寒试管，编号，按下表数据配制一系列不同浓度的标准葡萄糖溶液。 在每管中均加入0.5ml蒽酮试剂，再缓慢地加入5ml浓H2SO4，摇匀后，打开试管塞，置沸水浴中煮沸10分钟，取出冷却至室温，在620nm波长下比色，测各管溶液的光密度值（OD），以标准葡萄糖含量为横坐标，光密度值为纵坐标，作出标准曲线。 管 号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 标准葡萄糖原液(ml)(200μg/ml) | 0 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 | 蒸 馏 水 | 2.0 | 1.8 | 1.6 | 1.4 | 1.2 | 1.0 | 葡萄糖含量（μg） | 0 | 40 | 80 | 120 | 160 | 200 |
2．样品中可溶性糖的提取 称取1克白菜叶，剪碎，置于研钵中，加入少量蒸馏水，研磨成匀浆，然后转入20ml刻度试管中，用10ml蒸馏水分次洗涤研钵，洗液一并转入刻度试管中。置沸水浴中加盖煮沸10分钟，冷却后过滤，滤液收集于100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀备用。 3．糖含量测定 用移液管吸收1ml提取液于20ml具塞刻度试管中，加1ml水和0.5ml蒽酮试剂。再缓慢加入5ml浓H2SO4（注意：浓硫酸遇水会产生大量的热！），盖上试管塞后，轻轻摇匀，再置沸水浴中10分钟（比色空白用2ml蒸馏水与0.5ml蒽酮试剂混合，并一同于沸水浴保温10分钟）。冷却至室温后，在波长620nm下比色，记录光密度值。查标准曲线上得知对应的葡萄糖含量（μg）。 五、结果计算 样品含糖量（g/100g鲜重）= | 查表所得糖含量（μg）×稀释倍数 | ×100 | 样品重（g）×106 |
六、附注 （1）加浓H2SO4时应缓慢加入，以免产生大量热量而爆沸，灼伤皮肤，如出现上述情况，应迅速用自来水冲洗。 （2）水浴加热时应打开试管塞。 实验二 醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白一．目的 学习醋酸纤维薄膜电泳的操作，了解电泳技术的一般原理。 二、原理 醋酸纤维薄膜电泳是用醋酸纤维素薄膜作为支持物的电泳方法。 带电颗粒在电场力作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象称为电泳。由于各种蛋白质都有特定的等电点，如将蛋白质置于pH值低于其等电点的溶液中，则蛋白质将带正电荷而向负极移动。反之，则向正极移动。因为蛋白质分子在电场中移动的速度与其带电量、分子的形状及大小有关，所以，可用电泳法将不同的蛋白质分离开来。血清中含有多种蛋白质，它们的等电点都在pH 7.5以下。将血清放于pH 8.6的缓冲液电泳时，所有的血清蛋白都带有负电荷，在电场中将向正极移动。由于各种血清蛋白在相同pH时所带电荷数量不等，分子颗粒大小不一，因而泳动速度不同，经电泳被分离开来。血清蛋白质的等电点和分子量见下表。 蛋白质名称 | 等电点（pI） | 分 子 量 | 清蛋白 | 4.88 | 69 000 | α1-球蛋白 | 5.00 | 200 000 | α2-球蛋白 | 5.06 | 300 000 | β-球蛋白 | 5.12 | 9 000～150 000 | γ-球蛋白 | 6.85～7.50 | 156 000～300 000 |
本实验以醋酸纤维素薄膜（简称CAM）为支持物分离血清中的不同蛋白质。它是一种良好的呈均一泡沫状疏松薄膜，厚约120μm具有一定的吸水性。 三、实验材料、仪器及试剂 1．材料：健康人血清或鸡血清 2．仪器：电泳仪 电泳槽 3．试剂： （1）醋酸纤维素薄膜； （2）pH8.6巴比妥缓冲液（离子强度0.06～0.07）： 取巴比妥0.83克，巴比妥钠6.38克，加蒸馏水加热溶解后，定容至500ml。 （3）染色液：取氨基黑10 B 0.5克，溶于50ml甲醇中，再加冰醋酸10ml，蒸馏水40ml混匀。 （4）漂洗液：95%乙醇4.5ml，冰醋酸5ml，蒸馏水50ml混合。 （5）透明液：95%乙醇80ml，冰醋酸20ml混合。 四、实验方法 1．准备薄膜：将切割整齐的2.5×6cm的薄膜条，浸入巴比妥缓冲液中浸透后，取出，用吸水纸吸去多余缓冲液。 2．点样：仔细辩认薄膜的粗糙面与光滑面，在粗糙面距离薄膜一端1.5cm处，用铅笔轻轻划一条直线。用玻棒蘸上血清样品，涂于盖玻片边缘处（边缘长度应比膜条宽度窄），将此边缘按压在直线上。注意：样品应点在薄膜的粗糙面一侧。待血清完全渗入薄膜后，将膜面翻转，点样面（粗糙面）朝下，置电泳槽中，薄膜点样端放于负极一侧。 3．电泳：打开电源，调节电压110～130V，电流0.4～0.6m A/cm宽，电泳时间45～60分钟，电泳完毕后，关闭电源。 4．染色漂洗：将薄膜从电泳槽中取出，直接浸入染色液中约5分钟，再转入漂洗液中反复浸洗3～4次，直至背景颜色脱净为止。此时，正常血清蛋白在薄膜上显示出五条区带。从前端至点样处的方向分别为清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白及γ-球蛋白。 5．定量测定：时可将膜条用滤纸压平吸干，按区带分段剪开，分别浸在体积0.4mol/L氢氧化钠溶液中，并剪取相同大小的无色带膜条作空白对照，进行比色。或者将干燥的电泳图谱膜条放入透明液中浸泡2～3分钟后，取出贴于洁净玻璃板上，干燥后，即为透明薄膜图谱，可用光密度计直接测定。 五、注意事项 1．点样好坏是电泳图谱是否清晰的关键，点样量要适当。 2．漂洗时应多漂洗几次，直至无蛋白区底色脱净为止。
实验三 水稻种子中蛋白质和淀粉含量的测定目的意义： 水稻是重要的粮食作物之一，其品质优劣是值得人们重视的问题。一个高产水稻品种，往往由于食味差、或营养不丰富，而不受大众的欢迎。因此，在保证高产的同时，还要改善稻米的品质。本实验将测定大米品质的几个重要生化指标，为水稻育种提供理论依据。 Ⅰ 大米蛋白质含量的测定——考马斯亮兰G—250法 一、原理 考马斯亮G—250是一种染料，在游离状态下呈红色，在465nm波长处有最大光吸收。它能与蛋白质稳定结合，结合蛋白质后变为青色，在595nm处有最大吸收，在一定蛋白质浓度范围内（0～1000μg/ml），蛋白质—色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。该法反应迅速，蛋白质与考马斯亮兰G—250的结合反应能在2分钟内达到平衡。结合物在室温下1小时内保持稳定，反应非常灵敏，可测出微克级蛋白质含量，是最近新发展起来的一种较理想的蛋白质定量法。 二、实验材料、仪器及试剂 1．仪器： 721型分光光度计 离心机 50ml容量瓶 10ml刻度试管 研钵 量筒 移液管 2．试剂： （1）牛血清白蛋白（1000μg/ml）：称取100.00mg牛血清白蛋白，溶于100ml蒸馏水中，配制成标准蛋白质溶液。 （2）考马斯亮兰G-250溶液：称取100ml考马斯亮兰G—250，溶于50ml 90%乙醇中，加入85%（W/V）的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容到1000ml，过滤，常温下可放置1个月。 （3）0.1mol/LnaOH：称取4g氢氧化纳，用蒸馏水溶解，并定容至1000ml。 3．材料：大米粉 三、实验方法 1．标准曲线的制作： 取6只10ml刻度试管，编号，按下表数据配制牛血清白蛋白标准溶液。准确吸取上述各管溶液0.1ml，对应放于另外6支10ml刻度试管中，加入5ml考马斯亮兰G-250溶液，盖塞，将试管中溶液给向倒转混合，放置2分钟后，用10mm光径的比色杯在595nm波长下比色。以光密度值为纵坐标，以蛋白质浓度值为横坐标，制作出标准曲线。 管 号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 1000μg/ml牛血清白蛋白（ml） | 0 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 | 蒸馏水（ml） | 1.0 | 0.8 | 0.6 | 0.4 | 0.2 | 0 | 蛋白质浓度μg/ml | 0 | 200 | 400 | 600 | 800 | 1000 |
2．样品中蛋白质提取： （1）准确称取稻米粉0.5克，放入研钵中，加2ml0.1mol/L NaOH，研磨成匀浆，转入到10ml离心管中，再用6ml 0.1mol/ L NaOH分三次洗涤研钵，洗液一并转入10ml离心管中，用玻棒搅拌，放置30分钟，放置过程间断搅动数次。3500rpm离心15分钟，上清液转入50ml容量瓶中，用蒸馏水定容到刻度，摇匀，得碱溶性蛋白。 （2）将上述沉淀用70%乙醇重复提取，操作步骤同上，得醇溶性蛋白。 3．测定： 吸取提取液0.1ml，放入10ml具塞刻度试管中，加5ml考马斯亮兰G-250试剂，混匀，放置2分钟，用10mm光径的比色杯在595nm波长下比色（比色空白用0.1ml蒸馏水代替提取液与5ml考马斯亮兰G-250试剂混合），记录OD值。然后根据所测OD595nm在标准曲线上查出所对应的蛋白质浓度（C）。 四、结果计算： 蛋白质含量（%）= | 查表所得蛋白质浓度×提取液总体积 （μg/ml） （ml） | ×100 | 样品重（g）×106 |
五、注意事项： （1）由于此方法十分灵敏，因此，所用器皿必须清洗干净，取样必须准确，否则会造成很大的误差。 （2）定容时蒸馏水要沿着管壁缓慢加入，以免产生大量气泡，造成定容不准确，实验也会出现误差。 （3）谷物种子蛋白质主要是谷蛋白和醇溶蛋白，因此，稻米粉蛋白含量应为碱溶性谷蛋白和醇溶性蛋白含量之和。 Ⅱ 旋光法测定大米总淀粉 一、原理 淀粉因含有不对称碳原子，故具有旋光性。在加热条件下，淀粉可分散于稀盐酸溶液中，用磷钨酸沉淀蛋白质等其他旋光物质后，将溶液定容到一定体积。利用旋光仪测定出淀粉溶液的旋光偏振角。根据不同作物淀粉的比旋光度[α] ，可计算出总淀粉的含量。某些作物的淀粉比旋光度值如下：水稻淀粉：[α] = +185.9 马铃薯淀粉：[α] = +195.4玉米淀粉：[α] = +184.6 小麦淀粉：[α] = +182.7黑麦淀粉：[α] = +184.0 大麦淀粉：[α] = +181.5燕麦淀粉：[α] = +179.5 小米淀粉：[α] = +171.4二、实验材料、仪器及试剂 1．材料：稻米粉； 2．仪器：100ml烧杯 50ml容量瓶 研钵 玻棒 漏斗 旋光仪 3．试剂：① 1mol/L盐酸 ② 4%磷钨酸 三、实验方法 准确称取2g稻米淀粉样品，放入研钵，先磨成粉末状，然后加3ml 1mol/L HCL溶液研磨成匀浆，再加5ml 1mol/L HCL研磨，将溶液转入50ml容量瓶中。用20ml蒸馏水分次冲洗研钵，洗液一并倒入容量瓶中，摇匀后，放入沸水浴中煮沸，间隔摇动（其间打开容量瓶塞子）。加热15分钟后，稍冷却，加5ml 4%磷钨酸，并用蒸馏水定容至刻度，混匀。静置5分钟，将溶液过滤到一干净烧杯中，此时滤液应澄清透亮。将滤液装入2分米长旋光管，测定其旋光偏振角α值。 四、结果计算： 式中，α—用钠光时观测到的旋光度 [α] —淀粉的比旋光度L—旋光管长度（分米） W—样品重量（克） N—样品液总体积 ×100—换算为百分率 也可以不用上列公式计算，改用工作曲线求得淀粉含量，这样准确度高些。 五、附注： 1．比旋光度[α]是指偏振光经过1分米厚、浓度为1克/毫升的旋光性物质所旋转的角度： 式中，[α]指比旋光度，D指钠D线，20指温度。 2．WXG-4小型旋光仪使用方法： （1）先将仪器接于220伏交流电源，开启电源开关，约五分钟后，钠光灯发光正常，就可开始工作。 （2）检查仪器零位：在仪器未放旋光管或者放进充满蒸馏水的旋光管时，观察刻度盘指到零度时视野亮度是否一致，如下图（3）所示，但绝不是（4）。 （1） （2） （3） （4） 如不一致 [ 如上图（1）、（2）所示 ]，说明有零位误差，应在测量读数中减去或加上该偏差值。或放松刻度盘背面四只螺钉，微微转动刻度盘校正之（只能校正0.50左右的误差，严重的应送制造厂检修）。 （3）选取长度适当的旋光管，先用少量待测液将管内壁洗净后，注满待测溶液，装上橡皮垫圈，旋上螺帽，直至不漏水为止，在管内光线通道上，不应留有气泡。螺帽不要旋得太紧，否则护片玻璃会引起应力，影响读数的正解性。然后将旋光管两端的残余溶液揩干，以免影响观察清晰度和测定的精度。将旋光管放进仪器的管槽内。 （4）测定旋光度读数：转动刻度盘以带动检偏镜旋转，在视野中觅得亮度一致的位置[如图（3）所示]，再从刻度盘上读数。读数成正的为右旋物质，读数为负的系左旋物质。 （5）本仪器采用双游标读数法，可按下列公式求得结果： 式中A和B分别为两游标窗读数值 如A = B，且刻度盘转到任意位置都符合等式，则说明仪器没有偏心差（一般出厂前仪器均作过校正），可以不用对顶读数法。 （6）连续读数四、五次，计算其平均值。 （7）旋光度与温度有关，应尽量在20°±2℃的条件下观测（将恒温的水通入旋光仪夹套内，以保持旋光管内液体为2℃）。当温度升高1℃，旋光度约减少0.3%，可据此加以校正。 （8）观测完毕，将旋光管溶液倒出，洗净晾干后收藏。仪器如长时间不用，应即关闭电源开关。 3.自动旋光仪的使用方法： （1） 接通电源，开机预热使光源稳定； （2） 将清洗干净的旋光管装满蒸馏水进行校零； （3） 将样品装入旋光管进行测定； （4） 读数指示灯亮起后读数记录。 六、注意事项 （1）用磷钨酸沉淀蛋白质等有旋光性的物质时，一定要保证静置时间，否则溶液混浊，无法进行旋光度的测定。 （2）注意旋光管及其盖上的玻片不要损坏或丢失。 实验四 水稻萌发及幼苗期淀粉酶和过氧化氢酶活性测定 实验目的：淀粉酶几乎存在于所有植物中，其中以禾谷类种子的淀粉酶活性较强。水稻萌发时淀粉酶活性最强。水稻萌发时淀粉活性的大小与种子萌发力有关。过氧化氢酶也普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定联系。本实验通过对水稻萌发期淀粉酶活性测定以及对幼苗期过氧化氢酶活性的测定，学习和掌握淀粉酶和过氧化氢酶的测定方法，了解水稻生长与之代谢的关系。 Ⅰ 淀粉酶活性的测定 一、原理 淀粉酶能将淀粉水解成麦芽糖，由于麦芽糖能将3，5-二硝基水杨酸试剂还原成3-氨基-5-硝基水杨酸的橙红色化合物，且在一定范围内还原糖的浓度与反应液的颜色成正比，故利用比色法可求出麦芽糖的含量。以5分钟内每克样品水解产生麦芽糖的毫克数表示酶活性的大小。 植物淀粉酶可分为α-淀粉酶和β-淀粉酶两种，其中β-淀粉酶不耐热，在温度70℃以上易钝化：而α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下则发生钝化。根据以上特性，可分别测定这两种淀粉酶的活性。如测定α-淀粉酶和β-淀粉酶的活性，即为淀粉酶总活性。 二、实验材料、仪器及试剂 1．仪器： 20ml具塞试管 移液管 100ml容量瓶 石英砂 研钵 721型分光光度计 离心机 恒温水箱 离心管 2．试剂： （1）1%淀粉溶液：称1.0克可溶性淀粉，加入100ml蒸馏水煮沸。（临用时配 制） （2）pH5.6柠檬酸缓冲液：A、称取柠檬酸21.0克，溶解后定容至1000ml； B、称取柠檬酸钠29.4克，溶解后定容至1000ml；量取A液55ml与B液145ml混匀，即为pH5.6的缓冲液。 （3）0.4mol/L氢氧化钠溶液。 （4）3,5-二硝基水杨酸试剂：取1.0克3,5-二硝基水杨酸，溶于20ml mol/L氢氧化钠中，加入50ml蒸馏水，再加入30克酒石酸钾钠，待溶解后，用蒸馏水稀释至100ml，盖紧瓶盖，勿使二氧化碳进入。 （5）麦芽糖标准溶液：称取0.1000克麦芽糖，溶于少量蒸馏水中，然后定容至100ml，取为1mg/ml麦芽糖标准液。 实验材料：萌发水稻种子。 三、实验方法 1．酶液的制备：称取去根萌发水稻种子2克（含外壳），置研钵中，加1克石英沙研磨成匀浆。用8ml蒸馏水分次洗涤研钵，将匀浆转入离心管中，搅拌均匀后放置15～20分钟（间隔搅拌2～3次）。3500rpm离心10分钟，将上清液转入100ml容量瓶，用蒸馏水定容至刻度，得粗酶液。 2．α淀粉酶与β-淀粉酶的酶促反应： 取4支10ml具塞刻度试管，编号，按下表加入各液： 编 号 | 1（对照） | 2（对照） | 3（反应） | 4（反应） | 粗酶液（ml） | 1 | 1 | 1 | 1 | pH5.6缓冲液(ml) | 1 | 1 | 1 | 1 | 40℃水浴保温5分钟 | 0.4mol/L NaOH(ml) | 4 | 4 | 0 | 0 | 预热1%淀粉(ml) | 2 | 2 | 2 | 2 |
将以上各管混匀后，置40℃水浴准确保温5分钟，取出后立即向3、4号试管中加入4ml 0.4mol/L NaOH终止酶活性。 3．麦芽糖的测定： （1）标准曲线制作：取20ml刻度试管7支，编号，分别加入1mg/ml麦芽糖标准液0，0.2，0.6，1.0，1.4，1.8，2.0ml，然后各管加蒸馏水，使体积均达2ml，再向各管加3，5-二硝基水杨酸试剂2ml，置沸水浴中煮沸5分钟，取出后冷却，用蒸馏水稀释至20ml，摇匀后在520nm波长下用分光光度计比色，以光密度值为纵坐标，麦芽糖含量为横坐标绘制标准曲线。 （2）样品的测定：取以上酶作用后的反应液及对照管中的溶液各2ml，分别放入20ml具塞刻度试管中，加入2ml3，5-二硝基水杨酸试剂，置沸水浴中准确煮沸5分钟，取出冷却，用蒸馏水稀释至20ml，摇匀在520nm波长下用分光光度计比色，记录OD值，从麦芽糖曲线中查出相应麦芽糖含量，进行结果计算。 四、结果计算 淀 粉 酶 总 活 性 = [麦芽糖(mg)/鲜重(g)/5分钟] | （A—A′）×酶提取液总体积×酶反应稀释倍数 | 样品重（克）×显色所用样品液体积 |
A—为酶反应管中麦芽糖含量，即3，4号管中麦芽糖毫克数的平均值。 A′—为对照管中麦芽糖含量，即1，2号管中麦芽糖毫克数的平均值。 五、注意事项 （1）实验前应将所用研钵、试管、容量瓶等玻璃器皿冲洗干净，并注意移液管的分别使用，以避免酶遇强碱失活。 （2）注意控制好酶反应温度及pH值。 Ⅱ 植物组织中过氧化氢酶活性的测定 一、原理 过氧化氢酶能催化过氧化氢分解为水和氧。在过氧化氢酶液中加入一定量的过氧化氢，反应一定时间后，终止酶的活性，剩余的过氧化氢，以钼酸铵作催化剂，与碘化钾反应，游离出的I2用淀粉作指示剂，用硫代硫酸钠溶液滴定到蓝色消失为止，反应如下：
H2O2＋2KI＋H2SO4 I2＋K2SO4＋2H2O
I2＋2Na2S2O3 2NaI＋Na2S4O6 根据空白和测定二者之差，即可求出被酶分解的H2O2量，以每分钟过氧化氢酶分解底物H2O2的毫克数表示酶活性的大小。 二、实验材料、仪器及试剂 1．仪器： 三角瓶（100ml） 容量瓶（100ml） 滴定点 蝴蝶夹 酸式滴定管 恒温水箱 研钵 移液管 2．试剂： （1）碳酸钙（固体） （2）0.1mol/L Na2S2O4 （3）16%H2SO4 （4）10%钼酸铵 （5）1%淀粉 （6）20%KI （7）0.05mol/L H2O2 3．实验材料：白菜叶、水稻幼苗 三、实验方法 （1）酶液制备：取白菜叶2g，剪碎。加2ml蒸馏水和少许CaCO3粉末，研磨成匀浆，转入100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，静止片刻后过滤，取滤液10ml，再定容到100ml，摇匀备用。 （2）酶促反应：取100ml三角瓶，编号，按下表顺序加入各液： | 1（空白） | 2（空白） | 3（样品） | 4（样品） | 16%硫酸 | 5ml | 5ml | | | 粗酶液 | 10ml | 10ml | 10ml | 10ml | 在20℃水浴中保温平衡5分钟 | 0.05mol/L过氧化氢 | 5ml | 5ml | 5ml | 5ml | 加0.05mol/L H2O2后立即准确计时，20℃水浴中保温5分钟 | 16%硫酸 | | | ml | ml |
（3）滴定：向各瓶中加入1m120%KI溶液和3滴钼酸铵，均匀，用0.1mol/L硫代硫酸钠滴定，待溶液呈淡黄色时，再加5滴淀粉指示剂，此时溶液呈深蓝色，继续滴定到蓝色消失为止，记录消耗的硫代硫酸钠体积。 四、结果计算 分解的H2O2（mg）=[空白（ml）－样品值（ml）]× ×34.34过氧化氢酶活性(mg/g·分)= | 分解的H2O2量（mg）×酶液稀释倍数 | 样品重（g）×反应时间（分） |
M——硫代硫酸钠摩尔数；34.34——每毫克分子过氧化氢毫克数 五、注意事项 实验前应将所用三角瓶、容量瓶、研钵等玻璃器皿冲洗干净，并注意移液管的分析使用，以避免酶遇强酸失活。 一、目的 转氨基作用是植物界普遍存在的一种生化反应，它使蛋白质、氨基酸代谢与碳水化合物、脂肪等代谢沟通起来，在一定程度上起平衡蛋白质、脂肪等代谢的作用。研究植物体转氨基作用，可以使我们了解植物体不同发育阶段代谢动态的一个侧面，从而探索控制其代谢的途径。 二、原理 通过转氨基作用，α—氨基酸上的氨基可能转移到α—酮基的位置上，结果形成一种新的α—酮酸和一种新的α—氨基酸。所生成的氨基酸可用纸上层析法检出。 三、仪器和试剂 1．仪器： 研 钵 恒温箱 量筒（10毫升） 离心机 试管3支 层析缸 滤 纸 吹风机 移液管（0.5ml×3；2ml×1） 毛细管 漏 斗 离心管 2．试剂： （1）0.1M丙氨酸 （2）0.1Mα—酮戊二酸（NaOH中和至pH7） （3）含有0.4M蔗糖的0.1M pH8.0磷酸缓冲液 （4）0.1M谷氨酸、0.1—0.25%茚三酮丙酮溶液 （5）推动剂（酚：水＝3：1或4：1） 四、操作 1.酶液的制备：取发芽2-3日的绿豆芽3克（去皮），放入研钵中，加2毫升pH8.0磷酸缓冲液研成匀浆，转入离心管。研钵再用2毫升缓冲液冲洗，并入离心管，于8000转/分离心10分钟，取上清液备用。 2．酶促反应：取三支试管，按下表分别加入试剂和酶液： 管 号 | 0.1Mα—酮戊二酸（ml） | 0.1M丙氨酸 （ml） | 酶 液 （ml） | pH7.5缓冲液（ml） | 1 2 3 | 0.5 0.5 － | 0.5 － 0.5 | 0.5 0.5 0.5 | 1.5 2.0 2.0 |
摇匀后置试管于37℃恒温中保温30分钟。取出后各加3滴30%乙酸终止酶活动，于沸水浴上加热10分钟，使蛋白质完全沉淀，冷却后离心或过滤、取上清液或滤液备用。 3．层析：取层析滤纸一张，在距底边2厘米处用铅笔划一水平线，在线上等距确定5个点，作点样位置。相邻各点相距2.5厘米。取上述上清液或滤液及谷氨酸、丙氨酸标准液用五支毛细玻管分别点样。反应液点5-6滴，标准液点2滴。每点一次用吹风机吹干后再点下一次。不要点得太多，斑点直径不超过3㎜为宜（5支毛细管勿混淆）。 在层析缸中放入酚水推动剂(3：1或4：1)，待缸内蒸气饱和后，将滤纸垂直放入，展层，层析纸纸边不能迭在一起或与缸壁接触。盖好缸盖，待溶剂上升至10-15㎝时，小心取出滤纸用铅笔划出溶剂前沿线，用电吹风烘干。 4．显色：用喷雾器喷上0.1%茚三酮丙酮溶液，置烘箱(80℃)或用热吹风机加热显色，此时可见紫色斑点。 五、结果分析 样品层析后，常用相对移动速率Rf来表示各组分在层析谱上的位置： 原点至斑点中心的距离 Rf＝ Rf值与欲分离物质的性质存在一定的关系，在一定条件下是常数。 从层析图谱上鉴定α-酮戊二酸和丙氨酸是否发生了转氨基反应并写出反应式。 六、注意事项 1.品不要点得太多，斑点直径不超过3㎜为宜。 2. 层析纸质量要好一点，否则容易弯曲，层析效果不好。层析时，且纸边不能迭在一起或与缸壁接触。 实验六 不同作物不同发育时期过氧化物酶同工酶的比较分析 一、原理 聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺（简称Acr）和交联剂甲*双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂过硫酸铵（AP）和加速剂四甲基乙二胺（简称TEMED）的作用下，聚合而成的具有三维网状结构的凝胶，通过改变聚丙烯酰胺单体的浓度和交联度可以控制凝胶孔径的大小。通过改变催化剂的用量，可以控制凝胶聚合的速度。本实验采用不连续的电泳体系。以聚丙烯酰胺为支持物，采用电泳基质的不连续体系，即凝胶孔径的不连续性、缓冲液离子成分的不连续性、pH的不连续性和电泳过程中自动形成的电位梯度的不连续性，使样品在不连续的两相之间积聚浓缩成很薄的起始区带（约10-2cm），然后再根据电荷效应和分子筛效应进行分离。 二、实验材料、仪器及试剂 1、材料：水稻芽 水稻幼苗 灌浆期的叶片 小白菜叶片 玉米叶片 萌发4-5天的小麦芽 2、仪器：电泳仪 电冰箱 20×20（厘米）玻璃板一块 20×20（厘米）凹形玻璃板一块 玻璃注射器： 10毫升×1支 微量注射器 ：100微升1支 小烧杯2个 研钵1个 小白瓷盘 1个 3、试剂 1M HCl 48ml A Tris 36.6克 用蒸馏水定容至 100毫升，pH8.9 四甲基乙二胺（TEMED） 0.24毫升 Acr 28克 C 加水定容至100毫升， Bis 0.74克 pH8.9 G 过硫酸铵 0.56克 ， 用水定容至100毫升，一般现用现配 1M HCl 4 8毫升 B Tris 5.98克 用蒸馏水定容至 100毫升，pH6.7 四甲基乙二胺（TEMED） 0.46毫升 Acr（丙烯酰胺） 10克 D 加水定容至100毫升 Bis（甲*双丙烯酰胺） 2.5克 F 蔗糖40g加水溶解定容至100mL。 E 电极缓冲液： Tris 6克 加水溶解，定容至1000毫升，pH8.3，临用时稀释10倍 甘氨酸 28.8克 H 显色溶液：1. 称0.25克联苯胺溶解在18毫升冰醋酸中，用水稀释至100mL； 2．3%H2O2 I 固定液：7%的醋酸溶液 J 前沿指示剂：0.1%溴酚蓝水溶液 三、操作方法 1、粘板：取一块20×20（厘米）的玻璃板，在板的左、右、下三方边缘处用马铃薯淀粉糊将三块20×1.5（厘米）的有机玻璃条分别粘合，然后再盖上一块20×20（厘米）的凹型玻璃板。这样有机玻璃条被夹在两块玻璃板之间，以便留下灌胶的空隙，用铁夹夹紧固定在一有机玻璃的支架上，检查是否漏水（漏水则要重新粘板）。 2、灌胶：⑴下层胶的配制：将A、C、G、水以1：2：1：4的比例混合配制24ml于小烧杯中，马上灌入两玻璃板之间，（高度约为板的三分之二）然后用注射器在胶面上加一层水，使下层胶面平整。待凝胶聚合后，倾去水层，再用吸水纸轻轻吸干。 ⑵上层胶的制备：将B、D、G、F以1：2：1：4比例配8毫升灌注入下层胶上，高约为2-4厘米，立即插入一有机玻璃的梳状物，待上层胶凝固以后，取出梳状物，上层胶中即形成若干个凹形间隔（此间隔即是点样孔）。 3、电泳槽安装：将制好的板，从支架上取下，用镊子小心拨去下方的有机玻璃条，将*凹形玻璃板一面与电泳槽粘合，用铁夹固定。 4、样品的制备和点样：⑴样品制备：取① 2克萌发1-2天的水稻芽；② 2克水稻幼苗；③ 2克灌浆期的叶片；④ 2克小白菜叶片；⑤ 2克玉米叶片；⑥2克萌发4-5天的小麦芽。剪碎后，分别放在研钵中，各加入5毫升稀释5倍的电极缓冲液，磨成匀浆后在6000转/分下离心5分钟，取上清液2ml加入等体积40%蔗糖混合，用微量注射器吸收100微升点入上层胶各间隔中，再加入1滴蔗糖。向上、下槽注满电极缓冲液，再在上槽加2滴溴酚蓝作前沿指示剂，将上槽接上负极，下槽接上正极，打开电源开关，调节电流约12mA，半小时后，将电流增至24mA。待前沿指示剂到距板下至1厘米左右时， 关闭电源，停止电泳。 5、取胶和染色：将板从电泳槽取下，用镊子拨去二根有机玻璃条再小心将凹板揭开，将胶片托起放入盛有显色剂的白瓷盘中，直到可见至清晰的过氧化物酶同工酶棕色谱带，弃去显色剂，用蒸馏水冲洗胶片，然后，将胶片放入70%的醋酸溶液中保存。 四、结果观察和记录 五、注意事项 1．粘板一定要粘好，否则会漏胶。 2．电泳时，电流不可太大。太大会烧胶。电泳一般需要放在冰箱中进行， 以便于散热。
实验七 用SDS―聚丙烯酰凝胶电泳法测定蛋白质的分子量 一、原理 SDS 是一种阴离子表面激活剂，在蛋白质溶液里加入 SDS 和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原； SDS 能使蛋白质的氢键、疏水键打开并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质 -SDS 复合物。在一定条件下， SDS 与大多数蛋白质的结合比例为 1.4g SDS/1g 蛋白质。由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质的 SDS- 复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。 SDS 与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。蛋白质 -SDS 复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样，约为 1.8nm ，而长轴则随蛋白质的 M r 成正比的变化。基于上述原因，蛋白质 -SDS 复合物在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只与椭圆棒的长度有关， 也就是蛋白质 M r 的函数。 二、设备 1．垂直板电泳槽一套 2．直流稳压电源（500伏、100毫安） 3．抽气装置 4．10毫升注射器、100微量注射器各一支。 三、试剂 1．丙烯酰胺（Acr）贮液：30克Acr, 0.8克甲*双丙酰胺（Bis）。加水溶解定容至100毫升，过滤后使用，4℃下可贮藏1-2个月。 2．10%的SDS溶液。 3．10%的过硫酸铵溶液。 4．四甲基乙二胺（TEMED）。 5．分离胶缓冲液：1.0M pH8.8Tris-盐酸缓冲液，将12.1克用水溶解后，用6M盐酸调至pH8.8，用水定容至100毫升。 6．浓缩胶缓冲液，1.0M pH6.8Tris-盐酸缓冲液，将12.1克Tris用水溶解后用6M盐酸调至pH6.8，用水定容至100毫升。 7．电极缓冲液：将30.3克Tris 28.8克甘氨酸和2克SDS用水溶解后定容至200毫升，pH应为8.3，用时稀释10倍。 8．2X样品缓冲液，将2克SDS，5毫升β－巯基乙醇，10毫升甘油，2.0毫升0.1%溴酚蓝和2毫升试剂（6）混合，用水溶解并稀释到50毫升。样品为固体则稀释1倍使用，若为液体，则等量混合。 9．0.1%溴酚蓝溶液。 10．已知分子量的标准蛋白（M﹤10万）4-6种。 11．未知分子量的蛋白质样品。 12．考马斯亮蓝溶液：称取0.25克考马斯亮蓝R－250，加入45毫升甲醇，10毫升冰醋酸和45毫升水，过滤后使用。 13．脱色液：37.5毫升冰醋酸。25毫升甲醇，加水至500毫升。 14．SDS的重结晶：50克SDS加100毫升无水乙醇，70℃下保温溶解。趁热过滤后，于低温下过夜结晶，过滤，用少量无水乙醇或乙醚洗涤二次，于真空干燥器内干燥。 四、操作程序 1．电泳槽板的安装（略） 2．制胶 分离胶的配制 凝胶浓度 | 5% | 7.5% | 10% | 12% | 15% | 30%丙烯酰胺（ml） 1MTrls-HClpH8.8 （ml） H2O（ml） | 5.0 11.2 13.4 | 7.5 11.2 10.9 | 10 11.2 8.4 | 12 11.2 6.4 | 15 11.2 3.4 | 10%SDS（ml） 10%过硫酸铵（ml） TEMED（μ1） | 0.3 0.1-0.2 20 |
浓缩胶的配制 30%丙烯酰胺（ml） | 1.0 | 1MTrls-HClpH6.8 （ml） | 1.25 | H2O（ml） | 7.55 | 10%SDS（ml） | 0.1 | 10%过硫酸铵（ml） | 0.1 | TEMED（μ1） | 10 |
按上表比例配制分离胶，本实验分离胶浓度为12%。混匀后将胶液沿玻璃板壁缓缓地注入已准备好的凝胶模子中，注胶过程防止气泡产生，胶液加到玻璃板顶部3厘米处，立即用注射器覆盖3-5毫米厚的水层，垂直静置聚合。 按上表比例配制浓缩胶，立即将胶液注入胶模内，插好样品梳。样品梳的下端应距分离胶1厘米，浓缩胶高约3厘米，聚合后，小心地取出样品梳。 3．样品处理及上样 准确吸取蛋白质样品0.5毫升，加入0.5毫升的样品缓冲液，在45℃水浴中保温1小时，或在沸水中加热2-3分钟，蛋白质在SDS和β－巯基乙醇的作用下，变性，形成紧密的棒状SDS－蛋白质复合物。蛋白质浓度在0.5mg/ml左右为宜。用微量注射器吸取50微升样品。注入点样孔中。 4．电泳，加样后，向两槽内注入电极缓冲液，接通电源，上槽接电源负极，下槽接正极，开始控制电流为15-20毫安，染料进入分离胶后，加大到30毫安，电压在80-120伏。当指示染料到达胶长的四分之三以上时，即可停止电泳，电泳约需3-4小时，若用盘状电泳。当初始电流控制在每管1毫安，样品进入分离胶后，增大到每管2-3毫安，维持恒流，电泳约需3小时。 5．染色 胶取出后，在水中浸泡10分钟，浸出部分SDS，并用细铜丝对溴酚蓝带的位置进行标记，然后浸入考马斯亮蓝R250溶液中，30℃染色1小时，然后用水冲洗去凝胶表面的染料，放入脱色液中，于37℃下脱色1-2天，期间要经常更换脱色液。 五．结果计算 SDS-PAGE低分子量标准蛋白质 蛋白质名称 | 分子量 | 磷酸化酶B 牛血清蛋白 肌动蛋白 碳酸酐酶 胰蛋白抑制剂 鸡蛋清溶菌酶 | 97000 66200 43000 31000 20100 14400 |
以相对迁移率（mR）为横坐标，相对分子量（Mr）的对数值为纵坐标。在半对数坐标纸上作图，可得到一条直线，然后根据未知蛋白的迁移率，在半对数坐标上查出其对应的分子量。 五、注意事项 1．在不连续体系SDS-PAGE中,当分离胶加完后,需在其上加一层水。 2．样品液在加样前需在沸水中加热几分钟。 3．电泳时，电流不可太大，太大会烧胶。电泳一般需要放在冰箱中进行， 以便于散热。 实验八 植物基因组DNA的提取及含量纯度检测 目的意义 DNA是遗传信息的载体和基本遗传物质，它在遗传变异、代谢调控等方面起着重要作用，是分子生物学和基因工程研究的对象，但无论是研究植物DNA的结构和功能，还是开展外源DNA的转化、转导的研究，首先要做的就是从植物组织中提取天然状态的高分子量的纯化DNA。因此，本实验的目的是学习植物基因组DNA提取方法、原理和DNA的鉴定技术。 Ⅰ 植物基因组DNA的提取（CTAB法） 一、原理 植物组织中绝大部分是核DNA，它和组蛋白、非组蛋白结合在一起，以核蛋白（即染色质或染色体）的形式存在于细胞核内。CTAB(十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammonium bromide，简称CTAB)：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中(0.7mol/L NaCl)是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度(0.3mol/L NaCl)时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇中。 在DNA提取过程中必须始终注意以下几个关键问题： （1）DNA的二级结构和双链易受多种因素（如强酸、强碱、加热、低盐浓度、有机溶剂、酰胺类、尿素等）的影响引起双链解开，即“变性”，因此抽提时避免使用变性的条件。 （2）抑制内外源DNase的活力。DNase就象一把刀，它能把大分子的DNA切成碎片，所以要加以杜绝，现可以通过多种途径来做到这一点：a、低温操作；b、调节pH，使偏碱（pH8.0）；c、抽提液中加表面活性剂；d、加螯合剂（EDTA）除去酶的铺助因子（Mg2+），使酶活性丧失。 （3）防止化学降解。如过酸或过碱以及其它化学因素，会使DNA降解，一般综合考虑，取pH8.0左右为宜。 （4）防止物理因素降解。如温度太高或机械张力剪切等，DNA分子特别大，其分子量可达1012道尔顿，极易被机械张力拉断，甚至在细管中稍急一些的流动也会使DNA断裂，所以在抽提过程中要特别注意这一点，操作过程要尽量简便、温和、减少搅拌次数，也不要剧烈摇动。 （5）植物的次生代谢物（主要是胞质内的多酚类或色素类化合物）对核酸提取有干扰作用。因此，一般尽可能选幼嫩的、代谢旺盛的新生组织作为提取DNA的材料，这是因幼嫩的新生组织次生代谢物较少，DNA含量高，且易于破碎，植物材料最好是新鲜的。 分离提取植物DNA的方法很多，本实验采用CTAB法提取DNA并通过紫外吸收法和电泳鉴定。 二、实验材料、仪器及试剂 1、仪器 水浴锅：混匀器；高速冷冻离心机；移液器；754紫外分光光度计；液氮罐；水平电泳槽；电泳仪 2、材料与药品 水稻幼苗 液氮：吸头、小指管；氢氧化钠；溴代十六烷基三甲胺(CTAB)；三羟甲基氨基甲烷(Tris)；氯仿；乙醇；RNA酶；蔗糖；溴酚蓝；异戊醇；β-巯基乙醇；盐酸(HCl)；异丙醇；乙二胺四乙酸(EDTA) 3、 试剂 （1）DNA提取液 100mmol/L Tris, 20mmol/L EDTA, 20g/L NaCl 1.4mol/L NaCl pH8.0 （2）异丙醇(-20℃预冷) （3）溶液I：氯仿异戊醇(24：1) （4）5×TBE缓冲液 0.45mol/L Tris·H3BO3 0.5mol/L EDTA(pH8.0) （5）TE缓冲液 10mmol/L Tris·HCI 1mmol/L EDTA(pH8.0) （6）75%乙醇 (放-20℃冰箱中，用后即放回) （7）RNA酶 将RNA酶溶于10mmol/L Tris·HCI(pH7.5)、15mmol/L NaCl中，配成10mg/mL的浓度，于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，保存于-20℃。 （8）上样缓冲液：40%蔗糖、0.25%溴酚蓝 三、操作方法 （1） 取200mg样品(在液氮中研磨成粉末状)放入1.5mL离心管中，加入600μL DNA提取液，颠倒混匀5-6次。65℃保温35分钟以上，其间颠倒混匀一次。 （2）再加等体积的氯仿异戊醇(24：1)溶液轻轻摇晃30秒，在4℃下10000rpm/分钟离心10分钟后，取吸上清液(450μL) （3） 再加两倍体积的预冷异丙醇，混匀静止10分钟以上，在4℃下10000rpm/分钟离心10分钟后，弃上清。 （4） 用600μL70%乙醇洗涤沉淀，重复一次，在室温下倒置晾干。 （5）沉淀用TE溶液溶解DNA，再加入RNase至终浓度50μg/mL，在37℃下保温半小时，将DNA样品放入冰箱保存。 Ⅱ 植物DNA纯度的鉴定——紫外分光光度计法 一、原理 由于核酸中的碱基都具有共轭双键，所以具有紫外光吸收性质。核酸在紫外光谱区有一条典型的吸收曲线，其吸收高峰在260nm处，吸收低谷在230nm处。蛋白质在紫外区的吸收高峰在280nm处，所以核酸的紫外吸收光谱数据是鉴定核酸的重要依据之一。但紫外法不能区分DNA和RNA，只能用来鉴定核酸的纯度和含量。 纯度鉴定时，需测定在230、260和280nm处的消光值，经验数据表明，纯净的核酸溶液A260/A230的消光值比大于或等于2.0；A260/A280大于或等于1.80。A260/A280值过小，说明蛋白未脱净；A260/A230过小，说明有杂质（一般为多酚类或色素）。 含量测定时，对于纯净的DNA来说，在实际应用中可根据260nm处的消光值O.D260值换算成含量，一般认为O.D260值为1时，相当于50μg/ml。在测定核酸粗制品时，样品中残留的蛋白质和色素等与其它具紫, , , 外吸收的杂质对测定有明显干扰作用，大分子核酸制备过程中变性降解后有增色效应，因此有时此法测定的结果会高于定磷法。 二、实验材料、仪器及试剂 1、材料 植物DNA 2、器材：紫外分光光度计、移液管、试管 3、试剂：TE溶液（pH8.0）（见前述） 三、操作方法 将纯化的DNA溶液用TE（pH8.0）稀释至每毫升含5-50μg DNA浓度范围，用TE（pH8.0）作空白对照，于紫外分光光度计上测定260nm、280nm和230nm吸收值，计算A260/A230和A260/A280的比值，并换算出核酸的含量。 Ⅲ 植物DNA分子量的测定——琼脂糖凝胶电泳法 一、原理 以琼脂糖凝胶为支持介质的电泳广泛应用于核酸研究中，其操作简单、快速，是分离、鉴定、纯化DNA的标准方法。DNA分子在高于其等电点的pH溶液带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子在电场中通过凝胶介质而泳动，除电荷效应外，还有凝胶介质的分子筛效应，也就是说与分子大小构象有关。实验表明DNA迁移率与其分子量的对数成反比。因此通过参比已知标准分子量的DNA迁移率，可测定样品DNA的分子量。 用低浓度的荧光物质，插入性染料溴化乙锭（EB）使凝胶中DNA区带染色，在紫外光下可直接显示DNA在凝胶中的位置，灵敏度很高，可检出10ng（10-9g）或更少的DNA含量。 二、实验材料、仪器及试剂 1、材料： 植物DNA 2、器材：水平板型电泳槽装置 电泳仪 254nm波长的紫外分析仪 塑料手套 移液管 水浴锅 3、试剂： （1）T ris-HAc(TAE)缓冲液 A．浓缩的贮备液（50倍）每升含：242gTris 57.1ml冰醋酸，100ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0）。 B．使用浓度：0.04mol/L Tris-HAc/0.04mol/L EDTA。 （2） 琼脂糖：电泳纯以上。 （3）溴酚蓝甘油溶液（0.05%溴酚蓝-50%甘油溶液）：先配制0.1%溴酚蓝水溶液，然后取1份0.1%溴酚蓝溶液与等体积的甘油混合即成。 （4）已知分子量的标准DNA（λDNA-ECORI/Hind III）。 （5） 10mg/mL溴化乙锭水溶液（EB）或GV水溶液。 三、操作方法 1．琼脂糖凝胶板的制备 称取0.7g琼脂糖置于三角瓶中，加入100mlTAE缓冲液，在沸水浴中加热至琼脂糖完全溶解，冷却至50℃，然后加入EB溶液使终浓度为0.5μg/ml。倒入凹形有机玻璃槽（事先用胶带封住有机物玻璃板的边缘）。使其成2mm左右的凝胶板。在其未凝固前将样品槽模板（梳子）插入凝胶的一端，注意梳齿底与凝胶底之间应至少保持0.5-1.0mm的凝胶。待全部凝固后（室温，约30-45分钟），取出梳子及除去胶带，将凝胶板与玻璃板一起放入电泳槽内，加入TAE缓冲液使刚好超过凝胶面约1mm。 2．加样：将样品与溴酚蓝按4：1的比例混合，用移液器缓慢加入凝胶样品孔中，点样量为每孔5μgDNA。 3．电泳：点样端接负极，电泳开始时，可用较高的电压，如100伏特，这样可使样品很快进入胶内，而减少样品扩散，待样品进入胶内即可保持每厘米5伏特左右的电压，DNA在电泳中向正极移动。 当溴酚蓝的区带移至距凝胶底部1-2cm，停止电泳，当胶板为10-15cm的长度时，电泳时间一般为2小时左右。 (4)观察与鉴定 电泳结束后，取出凝胶板，在波长为254nm的凝胶成像系统下，观察电泳图谱，如果电泳条带清晰(如果EB染色看到桔黄色荧光条带，GV染色则看到绿色荧光条带)，将凝胶照相。根据标准DNA的电泳图谱，可以得知样品DNA的分子大小。 四、附注 1、溴化乙锭是一种很强的DNA诱变剂，接触含有该染料的凝胶或溶液时一定要戴上一次性塑料或者橡胶手套。 2、电泳后的凝胶板，不能倒在下水道里，应做专门的处理。
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