编者 刘清波 黄红梅 主审 周朴华 前 言 细胞工程是生物技术的主要内容之一，涉及的内容较广 ，主要包括：细胞培养、细胞融合、细胞拆合、生殖细胞、细胞转化等细胞水平的操作和技术。目的是改良生物品种、生产生物产品或组分。 细胞工程依研究对象不同，分为植物细胞工程和动物细胞工程。两者在研究内容及深度上已有较大的差别，最重要的差别是细胞全能性的表现。植物细胞全能性已完全得到证实和发展，即培养一个植物活细胞可以得到胚状体以至得到完整植株，并且每一个植物活细胞都具有该物种的生命属性，在合适的离体条件下，这些特征属性均可表现出来。动物细胞全能性证实工作直到1997年克隆羊“多莉”的培养成功才获得了阶段性突破。 细胞组织离体培养技术是细胞工程的基础技术和基本技能，也是基因工程、遗传工程等生命科学研究的重要手段。它是通过无菌操作，把不同的操作对象，如细胞、组织、器官等外植体接种于人工配制的培养基，给予人工控制的环境条件，使培育对象表现生命特征。 本实验指导侧重于植物细胞组织培养技术，内容分为10个实验。主要训练学生掌握植物细胞组织培养基本技能和操作要领，实验方法立足于初学者的专业基础和一般实验室的条件，将《细胞工程》课程的理论知识、一般的实验技能和科学研究的初步方法融为一体。培养学生理论联系实际、独立思考及实践动手能力。 本实验指导供生物技术、生物工程等专业学生使用。由于编者水平有限，加之时间仓促，错误在所难免，敬请各位师生批评指正。 编 者 2007．7
目 录 实验一 培养基母液配制……………………………………………3 实验二 培养基配制与灭菌…………………………………………7 实验三 植物器官愈伤组织的诱导…………………………………9 实验四 植物愈伤组织增殖…………………………………………12 实验五 植物愈伤组织分化…………………………………………14 实验六 植物器官型快速繁殖培养…………………………………16 实验七 花药培养及花粉发育时期的鉴定…………………………18 实验八 植物茎尖培养 ……………………………………………21 实验九 悬浮细胞培养 ……………………………………………23 实验十 原生质体培养 ……………………………………………26 植 物 细 胞 组 织 培 养 植物细胞组织培养是60年代以来植物细胞生物学中发展起来的一项生物技术。它是借用无菌操作方法，培养植物的离体器官、组织或细胞，使其在人工合成的培养基上，通过细胞的分裂、增殖、分化、发育，最终长成完整再生植株的过程。 植物细胞组织培养技术的研究，不仅具有重大的理论意义，而且在生产实践中也已显示了广阔的应用前景。例如，组织分化与形态建成问题，快速繁殖与去除病毒，花药培养与单倍体育种、幼胚培养与试管受精，抗性突变体的筛选与体细胞无性系变异，悬浮细胞培养与次生物质生产以及超低温种质保存等方面的深入研究和实际应用，都必须借助植物细胞组织培养技术的基本程序和方法。此外，植物细胞组织培养技术也有助于我们深刻理解植物细胞的全能性。
实验一 培养基母液配制 一． 实验目的 1. 了解植物外植体离体培养所需各种营养成分及激素种类 2. 初步掌握培养基母液配制方法 二． 实验原理 在配制培养基之前，为了使用方便、简化操作、用量准确，减少每次配药称量各种化学成分所花费的时间和误差，常常将配制培养基所需无机大量元素、微量元素、铁盐、有机物、激素成分分别配制成比需要量大若干倍的浓缩母液，置于冰箱内保存。当配制培养基时，按预先计算好的量分别吸取各种母液即可。 三． 实验用品 1．用具器材 电子天平（感量0.001g）、粗天平（感量0.5g）、冰箱、烧杯（1000ml、400ml、100ml、 50ml）、量筒（1000ml、100ml、50ml）、试剂瓶（1000ml、250ml、150ml）、药勺、玻璃棒 2．药品试剂 蒸馏水、1N HCl、1N NaOH、95%酒精、各种所需化学药品（分析纯） 四． 实验内容 母液配制方法以MS培养基为例。 1．无机大量元素母液的配制 按培养基配方的需要量，将各种化合物称量扩大10倍，用粗天平称取，并分别用200ml蒸馏水溶解于400ml烧杯中，如溶解速度慢，可稍加热。在1000ml烧杯中，按表1-1顺序依次混合已熔化合物溶液并搅拌，以免产生沉淀，用量筒定容至1000ml，倒入试剂瓶中并贴好标签。保存于冰箱冷藏室待用。 表1-1 MS无机大量元素母液配制 mg/L 化合物名称 培养基配方用量 扩大10倍称量 备注
KNO3 1900 19000 定容于1000ml蒸馏 NH4 NO3 1650 16500 水中。每升培养基取 MgSO4 ·7H2O 370 3700 此液100ml KH2 PO4 170 1700 |
CaCl2·2H2O 440 4400 2．无机微量元素母液配制 按培养基配方需要量，将各种化合物扩大10倍，用电子天平称取，并分别用50ml烧杯20ml蒸馏水溶解，在100ml烧杯中将上述溶液依次混合，用100ml量筒定容（药品已浓缩100倍），倒入试剂瓶中并贴好标签，保存于冰箱中。 表1-2 MS无机微量元素母液配制 mg/L 化合物名称 培养基配方用量 扩大10倍称量 备注 MnSO4 ·4H2O 22.3 223 定容于100ml蒸馏 ZnSO4 ·7H2O 8.6 86 水中。每升培养基 CuSO4 ·5H2O 0.025 0.25 吸此液10ml H3 BO3 6.2 62 Na2 MoO4 ·2H2O 0.25 2.5 KI 0.83 8.3 CoCl2· 6H2O 0.025 0.25 3．铁盐母液配制 按培养基配方需要量，将两种药品扩大10倍，用电子天平称取，分别在50ml烧杯中溶解后，再在100ml烧杯中混合，定容于100ml量筒（浓缩100倍），倒入棕色试剂瓶（因铁盐不稳定，易分解）中，贴上标签，置于冰箱中保存。 表1-3 铁盐母液配制 mg/L 化合物名称 培养基配方用量 扩大10倍称量 备注 FeSO4 ·7H2O 27.8 278 定容至100ml Na2 –EDTA 37.3 373 每次取用10ml 4．有机母液母液配制 按培养基配方需要量，将各种化合物扩大10倍，用电子天平称取，分别用50ml烧杯20ml蒸馏水溶解，在100ml烧杯中依次混合，100ml量筒定容（浓缩100倍），倒入试剂瓶中，贴上标签，置于冰箱冷藏备 表1-4 有机物母液配制 mg/L 化合物名称 培养基配方用量 扩大10倍称量 备注 甘氨酸 2.0 20 定容至100ml 盐酸硫胺素(维生素B1) 0.4 4 每升培养基取 盐酸吡哆醇(维生素B6) 0.5 5 此液10ml 烟酸 0.5 5 肌醇 100 1000 5．激素母液配制 各类激素用量较小，为了方便和准确，也配制成母液。母液浓度可依需要和习惯灵活确定。但注意各激素均不能直接用蒸馏水溶解，而用各种不同溶剂先溶解后再用蒸馏水定容。 例如2.4-D母液配制：称取40mg 2.4-D, 用少量95%酒精或1N NaoH溶解后，再用蒸馏水定容至200ml，此时，该激素母液浓度为1mg/5ml。 一般地，NAA、IAA、IBA等生长素是醇溶性的，均可用少量95%酒精先溶后再蒸馏水定容，而KT、6BA、ZT等细胞分裂素可先用少量1N HCl或1N NaoH溶解后再用蒸馏水定容。冰箱保存。 上述各种母液冰箱保存均不宜时间过长，储藏中如发现母液中出现沉淀或霉团时，应弃之。 五、作业 请写出你所配制的各种母液配方。
实验二 培养基配制与灭菌 一、实验目的 学习掌握培养基配制方法与灭菌操作 二、实验用品 1．用具器材 粗天平、电子天平、高压灭菌锅、塑料量杯、烧杯（500ml、100ml）、量筒（100ml、25ml、10ml）、移液管（5ml、1ml）、三角瓶（50ml）、玻璃棒、药勺、pH试纸（5.4-7.4）、橡皮吸球、橡皮筋、吸水纸、羊皮纸、防潮纸 2．药品试剂 蒸馏水、蔗糖、琼脂、1N NaOH、1N NCl、各种培养基母液。 三、实验内容 1．培养基配制 以MS1升培养基为例 (1)称琼脂7g（琼脂浓度0.7-0.8﹪）溶于2/3或一半以上所需培养基体积即700ml左右的蒸馏水中，用电饭锅（或微波炉）煮融。另称取蔗糖30g（糖浓度3%），待琼脂完全煮融断电后趁热加入，并搅拌使之溶解。 煮琼脂的同时，可用量筒或移液管依次量取各种母液混合于一烧杯中：无机大量母液100ml，无机微量、有机物、铁盐母液各10ml，激素母液种类及取量依不同培养基配方临时确定。 (2)将（1）、（2）液体混合，并用蒸馏水定容为1000ml。 i. 用1N NaOH或1N NCl调pH值至5.8，调时应不断用玻璃棒搅动，并用 pH试纸测试。 (3)趁热将培养基分装于约30个三角瓶（50ml）中，每瓶约30ml。分装时应避免把培养基倒在瓶口上，否则易引起杂菌污染。 (4)用羊皮纸、橡皮筋封口，并可在纸盖上用铅笔写明培养基代号。 2．培养基灭菌 把分装好的培养基、无菌水及无菌纸放入高压灭菌锅内，锅外层加水后，拧紧锅盖，关闭放气阀和安全阀，接通电源，开始加热，当温度上升指针移至0.5kg/cm 时，开气阀排除冷气，使压力表指针复零位，按同样方法再排一次冷气，关好放气阀继续加热至1.1-1.2kg/cm 时，保持该压力15-20分钟（温度为121-126℃）后切断电源，打开放气阀，慢慢放热气，锅内蒸汽完全放出，气压归零后打开锅盖，趁热将培养基取出，待冷却后使用。 四．作业 请写出你所配置培养基的主要步骤和过程
实验三 愈伤组织的诱导 一． 实验目的 1．了解无菌培养对实验材料消毒、接种的要求 2．初步掌握植物外植体材料灭菌方法及接种操作技术 3．了解外植体愈伤组织诱导过程 二．实验原理 以植物体中分离出来的器官组织为外植体，在人工培养基和激素诱导下，均可保证离体组织延续生长，产生愈伤组织。从模式植物胡萝卜直根切下的外植体容易培养产生上述结果。茎叶外植体也可诱导愈伤组织发生。此外，选取种子胚直接诱导愈伤组织也容易成功。利用比较简单材料掌握培养原理后，再进行困难的、有兴趣的实验会容易得多。 三. 实验用品 1．用具器材 超净工作台、枪式镊子、解剖刀、酒精灯、酒精缸、玻璃记号笔、脱脂棉、火柴、加盖小烧杯、废液杯、刀片 2． 药品试剂 70%酒精、灯用酒精、0.1%升汞溶液、已灭菌培养基及无菌水、无菌纸 3．实验材料 新鲜胡萝卜或水稻稻种（带谷壳）等 四．实验内容 1．接种前准备 （1） 按本实验目的事先配好培养基 胡萝卜愈伤组织诱导培养基：MS+2.4-D 2mg/L+KT 0.2mg/L 其他接种材料培养基：MS+2.4-D 2mg+6BA 0.2mg （2） 接种室准备 打开超净工作台开关（接种前开机15-30分钟），拖地板减低室内灰尘，台内用70%酒精棉球擦拭干净（或喷雾消毒），台面上放置以下用具：酒精灯、70%酒精缸、酒精棉球瓶、加盖小烧杯、废液杯、枪式镊子、解剖刀、无菌水、无菌纸、培养基、新鲜材料 2．接种前准备 培养材料灭菌，是组培技术中的重要环节，一方面要考虑灭菌剂的杀伤效力，同时，也要考虑植物材料的受损情况。所以灭菌时间长短很重要。 灭菌时，将选出的健壮无病、幼嫩的茎叶材料稍处理至能放入加盖小烧杯中，玉米将籽粒剥下、胡萝卜用刀片刮去皮切成小块、水稻剥去谷壳后均放入小烧杯中，倒入升汞盖盖灭菌10分钟（具体时间依材料而定），其间稍加摇动以充分灭菌。也可在此之前先用70%酒精浸30秒或1分钟表面消毒后，再用升汞灭菌。10分钟后，倒去升汞溶液，用无菌水反复冲洗材料3遍以上，将升汞溶液及废水倒入废液杯中。 3．接种 （1）接种前用肥皂洗手（穿工作服，戴口罩和工作帽），然后用70%酒精棉球擦 手表面消毒。 （2）将超净工作台上三角瓶的封口橡皮筋打开，整齐排列在接种台左侧。 （3） 点燃酒精灯，将所用镊子、刀在酒精缸内沾以70﹪酒精后，在酒精灯火焰上灼烧灭菌，灼烧灭菌后放在支架上以防再污染。在整个接种过程中，应每隔一段时间便将刀、镊子沾酒精灼烧一下灭菌，冷却后再用。 （4） 用镊子打开无菌纸包装，夹出几张无菌纸置于台中央。 （5） 外植体处理：用无菌镊子取出外植体，置于纸上吸水并进行切割。茎段切成1cm左右长，嫩叶切成 1cm2大小。玉米粒用无菌解剖刀和镊子轻轻剥去果皮（也是种皮），小心切下胚（白色），去掉胚乳（黄色）。水稻完整籽粒在无菌纸上沥干水分即可。胡萝卜块用解剖刀切成一系列1mm左右厚的薄片，每片切成通过形成层的5mm见方的小块，这样每块外植体都包含韧皮部、形成层和木质部三部分，其外植体大小及厚度尽量一致。 （6） 在酒精灯上方，左手握住三角瓶，右手轻轻打开并拿掉包头纸，将纸盖外面朝上置于台面上。右手用镊子将茎段、叶或胡萝卜片平摆放于培养基表面，玉米胚或水稻籽粒平放或斜插均可，轻轻按住外植体使其接触培养基。注意接种材料要摆放均匀且保持一定密度，完毕后将三角瓶瓶口在酒精灯火焰上灼烧一下，然后用瓶盖封口，扎好橡皮筋，并用玻璃记号笔在瓶下方注明材料代号、培养基代号、接种日期及姓名等。 (7) 将培养基放入培养室指定培养架上培养。 注意在超净工作台上接种时，应尽量避免说笑，打喷嚏。打开包头纸时，注意不要污染瓶口，并进行瓶口灭菌。另外还应注意，手臂切勿从培养基、无菌材料、切割用的无菌纸、接种器械上方经过，以避免再度污染。 五．培养与观察 接种后一周内，如有污染情况即可观察到，真菌污染菌丝清晰可见，呈黑、白各色。如细菌污染，为粉红、白色或黄色粘稠菌斑，发现污染应及时转移未污染材料或处理掉。未污染培养2-4周后，可在外植体或其切口处观察到已长出的疏松呈颗粒状愈伤组织。 六．作业 记录接种情况并统计愈伤组织出愈率及污染情况。 实验四 植物愈伤组织增殖 一、实验目的 了解愈伤组织离体条件下增殖过程及条件。 二、实验原理 植物生长调节剂是诱导愈伤组织增殖的重要因素，对有些植物材料而言，生长素和细胞分裂素对保持愈伤组织的快速生长是必要的，特别是两者结合使用时，能更强烈的刺激愈伤组织的形成。 三、实验用品 1．用具器材 超净工作台、枪式镊子、解剖刀、酒精灯、酒精缸、记号笔、脱脂棉、火柴、刀片 2．药品试剂 70%酒精、灯用酒精、0.1%升汞溶液、无菌纸、无菌水、已配制好的培养基（以下培养基配方供参考） 愈伤组织增殖培养基：MS+2，4-D 0.5mg/L+CH 500mg/L + 3%蔗糖+0.7%琼脂 3．实验材料 各类已诱导产生的愈伤组织 四、实验内容 将水稻种胚诱导产生的愈伤组织或胡萝卜根外植体产生的愈伤组织在无菌纸上切割成5×5mm大小，转移至上述愈伤组织增殖培养基上培养。 五、作业 记录每瓶培养基接种材料名称、外植体数，2-3周后统计愈伤组织生长情况。 实验五 植物愈伤组织分化 一．实验目的 了解愈伤组织离体条件下形态发生、器官再生作用。 二．实验原理 由离体培养愈伤组织细胞再生成完整植株有两种不同方式：一是通过茎芽分化，再诱导生根，形成小苗；二是通过体细胞胚胎发生形成小苗。前者是一种单极性结构，后者是一种双极性结构。 三．实验用品 1．用具器材 超净工作台、枪式镊子、解剖刀、酒精灯、酒精缸、记号笔、脱脂棉、火柴、刀片 2．药品试剂 70%酒精、灯用酒精、0.1%升汞溶液、无菌纸、无菌水、已配制好的培养基（以下培养基配方供参考） 水稻茎芽分化培养基：MS+6BA 2mg/L 胡萝卜胚胎发生培养基：MS 无激素培养基 MS+2.4-D 5mg/L (对照) 3．实验材料 各类已增殖培养的愈伤组织 四．实验内容 1．茎芽分化 将水稻种胚诱导产生的愈伤组织（或已继代）在无菌纸上切割成5×5mm大小，转移至MS+6BA 2mg/L培养基上诱导成芽。 2．胚胎发生 将胡萝卜根外植体产生的愈伤组织（或已经继代）分别接种于无激素和含激素2.4-D培养基上，诱导胚状体形成。 五．作业 记录每瓶培养基接种材料名称、外植体数，2-3周后统计水稻外植体发芽率及胡萝卜外植体胚状体诱导率。比较胡萝卜愈伤组织在两种培养基中的生长和分化情况。 实验六 植物器官型快速繁殖培养 一. 实验目的 1．了解离体无性繁殖器官发生方式中器官型的特点 2．进一步熟练掌握无菌操作过程 二. 实验原理 植物离体快速无性繁殖时，因植物种类的不同，外植体类型的不同及培养基成分的不同，器官再生途径也会有很大差异。其中，器官型方式是指从器官外植体直接诱导不定芽再生植株的方式。 三．实验用品 1．用具器材 超净工作台、枪式镊子、解剖刀、酒精灯、酒精缸、脱脂棉、火柴、废液缸、记号笔、加盖小烧杯、刀片 2．药品试剂 70%酒精、灯用酒精、0.1%升汞溶液、无菌纸、无菌水、已配制好的培养基（MS+6BA0.5mg/L） 3．实验材料 新鲜百合或大蒜鳞茎、油菜花苔（某些植物的花葶） 四、实验内容 1．灭菌 将实验材料的外植体用自来水冲洗干净或直接用70﹪酒精擦洗干净，再用0.1﹪升汞溶液灭菌10分钟，无菌水反复冲洗3次以上，倒去水分。 2．接种 将实验材料灭菌后的外植体，如百合鳞片切成1cm2左右大小，接种到培养基上，注意将鳞片凹面（里面）向上。 五、作业 记录每瓶培养基接种材料外植体数，2-3周后统计外植体发芽率及污染情况。
实验七 花药培养及花粉发育时期的鉴定 一、实验目的 1．了解花药（粉）培养诱导花粉形成愈伤组织过程及再生植株条件 2．观察了解花粉发育各时期形态 二、实验原理 离体花药（粉）培养在一定条件下可诱导花粉形成单倍体植株，单倍体植株加倍后可得到纯合二倍体，缩短育种年限，加快育种速度。 花药和花粉离体培养中，花粉的发育时期是提高花粉植株诱导频率的重要因素。准确地鉴定花粉的发育时期，做到适期及时地接种是花药、花粉离体培养中十分重要的操作技术。 三、实验用品 1．用具器材 超净工作台、解剖镊子或解剖针、普通尖镊子、酒精灯、酒精缸、小烧杯（加盖）、记号笔、脱脂棉、火柴、载玻片、盖玻片 2．药品试剂 70%酒精、灯用酒精、0.1%升汞溶液、碘—碘化钾溶液或醋酸洋红液、无菌水、无菌纸、已配制好的培养基（MS或N6+2.4-D 2mg/L+NAA1.5mg/L+蔗糖5%） 3．实验材料 水稻颖花和某种双子叶植物花蕾新鲜材料 四、实验内容 （一）花药培养 1．预处理 为了取得最好效果，花药接种之前，可先预处理，最常用最简便的方法是5～7℃低温冷藏。即将带叶鞘的穗子（或花蕾）用湿纱布包裹后再用塑料袋套起，放入冰箱冷藏，一般处理7-15天。 2．具体操作过程（以水稻花药为例） （1） 取单核中期至晚期的颖花，此时颖花外观呈黄绿色，花药顶部处于颖花高度的1/3左右，花药颜色为淡黄绿色。在接种前将颖花用0.1%升汞溶液消毒10分钟，无菌水清洗多次之后，在超净工作台上用解剖镊子（或尖镊子）剥开外稃、内稃（颖花），将花药取下接种于培养基上。注意花药接种有密度效应，不能接种太稀疏。接种后的花药置于27℃的培养室中进行暗培养。 （2）愈伤组织出现后10天左右（大小似小米粒）即可转至分化培养基，进行分化培养。分化培养基的成分为：MS+NAA 1mg/L+IAA0.5mg/L+KT2mg/L+蔗糖3%+琼脂0.6～0.7 %。分化培养的最初3-5天先在暗中进行，然后再转入1000-2000lx光强，每天14小时光照下培养，培养温度仍为27℃。 （3）将在分化培养基上陆续出现的绿苗，分批转至含有IAA0.2mg/L半量MS大量元素、全量铁盐和其他成分、蔗糖1.5%、琼脂0.8%的培养基上进行壮苗。 （二）花粉发育时期鉴定 1．鉴定方法 取新鲜的或固定液中的花药一个，置于载玻片上，用吸水纸吸去水分或固定液，滴上一滴碘—碘化钾或醋酸洋红液，用解剖针或镊子一端，在染色液中将花药轻轻压碎，目的是使花粉从药囊中游离出来。然后弃去药壁残渣，盖上盖玻片。在酒精灯火焰上迅速来回烤几次。目的是破坏染色质，促使细胞核着色，同时驱赶气泡。可随时用手背测试温度，注意不可过热或煮沸，待制片冷却后，可在显微镜下检查。 2． 花粉发育时期的特征 四分孢子期：花粉经过减数分裂后，形成连接在一起的四个小孢子。显微镜检时，在一个平面上往往能看到四个小孢子及小孢子核。在同一个平面上看到三个小孢子及小孢子核的情况较少。 单核期：又分单核早期、单核中期和单核晚期。 单核早期：细胞体积较小，相比之下核显得大、核位居正中，细胞质没有液泡化。 单核中期：细胞体积增至正常大小。细胞质中开始出现小液泡，细胞核开始向边缘移动。 单核晚期：胞质中小液泡连成大液泡。核被挤到边缘*近细胞壁。这一时期也称单核*边期。 双核期：单核小孢子第一次有丝分裂后，形成两个形态、大小不同的子核。一个是染色质松散、染色较浅的营养核。另一个是染色质紧密，染色较浓的生殖核。 三核期：三核期由于淀粉的大量累积，细胞核内状况不易观察。二核型花粉生殖核的分裂往往要在花粉管伸长之后才能见到。 五．作业 1．认真镜检花粉各发育时期，特别是该种植物花粉离体培养时常用的花粉发育时期外部特征。 2．每人用绘图纸绘出单核早期、单核晚期、双核早期细胞图各一张（注意绘图时细胞直径不小于3cm）。 3．记录每瓶培养基接种材料名称、花药外植体数，2-3周后统计花药外植体愈伤组织诱导率。 实验八 植物茎尖培养 一．实验目的 1．了解生物脱病毒最有效的方法茎尖培养过程 2．初步掌握茎尖剥离技术 二、实验原理 植物茎尖可以在完全无菌条件下切下来并培养成功，由于茎尖分生组织几乎不含病毒，所以这项技术越来越多地被人们用来从受病毒侵染的营养繁殖植物无性系中获无病毒植株，并用来建立原种快繁培养，本实验选用的吉祥草，终年生长，容易产生腋芽，且茎尖较容易剥离。 三、实验用品 1. 用具器材 超净工作台、解剖镜（实体显微镜）、解剖镊（针）、普通尖镊、酒精灯、酒精缸、小烧杯（加盖）、记号笔、脱脂棉、火柴 2. 药品试剂 70%酒精、灯用酒精、0.1﹪升汞、无菌纸、无菌水、已配制好的培养基（ MS+NAA 1mg/L） 3. 实验材料 吉祥草新鲜材料 四、实验内容 在野外采回吉祥草腋芽或小苗，剥去大部分幼叶后升汞灭菌5分钟，无菌水反复冲洗干净。 无菌条件下，在解剖镜下用解剖针或镊子层层剥去外面叶片，直至茎尖暴露出来，茎尖为透明，有一点弹性的长圆锥体。如太幼嫩，则成粘稠状。用针或解剖刀小心切下茎尖（不足1mm长）转移至培养基中培养。 五、作业 记录每瓶培养基接种外植体数，2-3周后观察并统计茎尖外植体生长情况。 实验九 悬浮细胞培养 一、实验目的 了解液体培养建立细胞悬浮培养系的过程 二、实验原理 在摇动的液体培养基中做植物组织培养，可以消除许多在固体培养基上培养的不利之处，培养物在液体培养基中的运动促进气体交换，消除了由于重力而产生的组织极性，也消除了培养基中和细胞表面的营养梯度。在摇床上摇动液体培养基，培养疏松易碎愈伤组织，最终将产生由单个细胞或由2～10多个细胞团组成的、能活跃生长的细胞悬浮液。 三、实验用品 a) 用具器材 超净工作台、摇床、枪式镊子、解剖刀、酒精灯、酒精缸、记号笔、火柴、脱脂棉 b) 药品试剂 70%酒精、灯用酒精 液体培养基：MS+2.4-D 5mg/L 3．实验材料 胡萝卜疏松愈伤组织 四、实验内容 a) 将配制好的装入250ml三角瓶内的液体培养基MS+2.4-D 5mg/L(无琼脂)在超净工作台上分别倒入已灭菌的50ml空三角瓶，每瓶约20-25ml。 b) 取出已诱导产生的疏松易碎胡萝卜愈伤组织转入液体培养基中，放在25℃黑暗或弱光条件下，用摇床培养（转速80-100rpm）。 五、观察与结果 通常，每隔7天继代培养一次，在上述条件下经3～4次继代培养后，胡萝卜悬浮培养物已分散成单细胞和小细胞团集合体。悬浮细胞的生长速度与接种时的细胞密度有关。因此，测定接种细胞密度非常重要。如接种物密度低于最适量时，细胞生长较慢或不生长；反之，细胞的对数生长期缩短，这些培养物的生长速率较早降低且停止生长。就胡萝卜细胞悬浮液而言，细胞密度为105～3×105个/ml或接种物鲜重100～300mg接种到60ml培养基中适宜。 六、作业 记录实验开始日期、接种细胞起始密度和持续期，每隔3天对悬浮培养物观察一次，记录培养物在形态上的变化和污染的情况。学习测定细胞密度的方法。 附录： 一． 培养细胞的计数方法 细胞计数一般用血球计数板,按一定计数方法进行计数。血球计数板是一个特制的载玻片。每个划线区由“井”字形粗线分成9个区域。每个区域长1mm，宽1mm，凹槽深度为0.1mm，体积为1mm2 ×0.1mm = 0.1mm3 ( 即0.1ml )。每个区域又可划分为25个方格。细胞计数时，在每25个方格中，细胞数不应少于50～100个。 具体操作方法如下： 1．首先吸取细胞悬液1滴至血球计数板上。 2．将盖玻片由一边向另一边轻轻盖上，注意防止气泡形成。 3．数分钟后，即可在显微镜下计数。 4．每个样品计数6个重复，然后平均,最后算出单位体积中的细胞数目。 二．培养细胞体积的测定 在细胞悬浮培养物的生长周期中，以一定的间隔期测量所选择的参数，可以追踪它的生长过程。可以利用的参数有细胞数目、干重、鲜重、细胞体积等。但测定前几种参数比较费时，而测定密接的细胞体积（简称PCV）是一项操作简单、迅速且有效的技术。细胞体积在一定范围内也反映了悬浮细胞的增殖状态。一般培养细胞增殖速度越快，细胞体积（重量）越小。PCV的测量方法是取15ml悬浮细胞培养液，放入刻度离心管中，2000g/分离心5分钟。以每毫升培养液中的细胞体积毫升数来表示。这种方法虽然简便，但不够精确，容易产生误差。 三．植板率测定 用平板法培养单细胞或原生质体时，细胞的增殖状况常以植板率来表示。植板率是指能长出细胞团的细胞占接种细胞总数的百分数。用公式表示为 每个平板上形成细胞团的细胞数目 植板率 = ×100﹪ 每个平板上接种的细胞数
实验十 原生质体培养 一、实验目的 掌握植物原生质体分离和培养的基本方法，并对培养的结果进行初步观察。 二、实验原理 原生质体是除去细胞壁的裸露细胞。在适宜的培养条件下，分离的原生质体能合成新壁，进行细胞分裂，并再生成完整植株。 植物的幼嫩叶片、子叶、下胚轴、未成熟果肉、花粉四分体、培养的愈伤组织和悬浮培养细胞均可作为分离原生质体的材料来源。已证明植物叶子是最好的材料，特别是烟草。胡萝卜培养也是一种较容易操作的材料。 分离原生质体常采用酶解法和机械法。原生质体的产率和活力与材料来源、生理状态、酶液的组成、以及原生质体收集方法有关。酶液通常需要保持较高的渗透压，以使原生质体在分离前细胞处于质壁分离状态，分离之后不致膨胀破裂。渗透压稳定剂常用甘露醇，山梨醇，葡萄糖或蔗糖。酶液中还应含一定量的钙离子，来稳定原生质膜。游离出来的原生质体可用过筛—低速离心法收集，用蔗糖漂浮法纯化，然后进行培养。 三、实验用品 1．用具器材 超净工作台、台式离心机或手摇离心机、倒置显微镜、普通显微镜、灭菌锅、血球计数板、石蜡膜带。酒精灯、酒精缸、记号笔、火柴、脱脂棉。 细菌过滤器和0.45μm的滤膜、300目不锈钢网筛及配套的小烧杯、解剖刀、尖头镊子、注射器（5、10ml）和12号长针头、带皮头的刻度移液管（5、10ml，上部管口加棉塞）、培养皿（直径6cm）或扁平培养瓶（50ml）、大培养皿、吸水纸、离心管等，使用前需经过灭菌。 2．药品试剂 70%酒精、灯用酒精、0.1%升汞溶液，灭菌水、0.16 mol/L和0.20 mol/L CaCl2·2H2O溶液并加有0.1%MES（2-N-吗啉乙烷磺酸）、pH5.8-6.2，20%和12%蔗糖溶液、pH5.0-6.2。 酶液A 纤维素酶（cellulase, Onozuka R-10） 2% 果胶酶（pectinase, Serva） 1% (若用国产EA3-867纤维素酶，则果胶酶可省去。) 甘露醇 0.6mol/L CaCl2·2H2O 0.05mol/L MES 0.1% PH 5.8-6.2 酶液B 纤维素酶（Onozuka R-10） 2% 离析酶（Macerozyme R-10） 1% 半纤维素酶（hemicellulase,Sigma） 0.2% 甘露醇 0.4 mol/L CaCl2·2H2O 0.05 mol/L MES 0.1% PH 5.8-6.2 上述酶液用过滤法灭菌。 3．实验材料 烟草或其他植物新鲜叶片、胡萝卜疏松的愈伤组织 四、实验内容 1．叶肉原生质体的分离和培养 ⑴ 取充分展开的叶片，用自来水冲洗干净。（以下步骤均在超净台上进行）。 ⑵ 将叶片在0.1升汞溶液中浸泡灭菌10分钟，中间摇动几次。取出后用无菌蒸馏水漂洗5次。 ⑶ 将叶片移入大培养皿中，用吸水纸吸去上面的水珠。然后将叶背朝上，小心用尖镊子尽可能完全撕去下表皮。 i. 撕去下表皮后的叶片放进预先放有酶液A的培养皿或带盖三角瓶中，每10ml酶液约放2g叶片。若叶片不易撕下下表皮，可用锋利的解剖刀将叶片切成约0.5cm宽的小条，放入酶液。 ii. 培养皿用石蜡膜带封口，在28℃条件下保温3-6小时，中间轻轻摇动2-3次。在倒置显微镜下检查，直到产生足够量的原生质体。 iii. 酶解后的原生质体悬浮液用不锈钢网筛过滤到小烧杯中，以除去未酶解完全的组织。 iv. 将滤液分装在刻度离心管中，用600r/分钟的速度离心5分钟，使原生质体沉淀下来。 v. 用移液管吸去上清液。将沉淀的原生质体悬浮在2ml 0.2 mol/L的CaCl2·2H2O中。 vi. 用注射器（装上长针头）向离心管底部缓缓注入20%蔗糖溶液6ml，在600r/分钟下离心5分钟。此步完成后，在两相溶液的界面之间将出现一层纯净的完整原生质体带，杂质、碎片将沉到管底。 vii. 用注射器吸出管底杂质和下部的蔗糖溶液及上部的CaCl2·2H2O溶液。 viii. 离心管中留下的纯净原生质体用8ml 0.2mol/L CaCl2·2H2O悬浮。离心5分钟，吸去上清液。再用培养基如法洗涤一次。 ix. 将收集的原生质体悬浮在适量的培养基中，将其密度调整到5×104/ml左右（可用血球计数板统计原生质体的密度）。 x. 用带皮头的刻度移液管将原生质体悬液分装在培养皿中，每皿放2ml。 xi. 用石蜡膜带封口。置26℃左右条件下进行培养。 2．愈伤组织原生质体的分离和培养 ⑴ 取继代培养一周左右，并处于旺盛生长期的胡萝卜疏松愈伤组织，直接放在酶液B中，每10ml 酶液放2克左右。在室温下保温过夜，或26℃下保温6小时以上，直到产生足够量的原生质体。 ⑵ 将酶解后的原生质体悬液用不锈钢网筛过滤，除去未完全消化的组织。 ⑶ 向过滤液中加入等体积的0.16mol/L CaCl2·2H2O溶液，混合之后转移到带盖离心管中。在600r/ 分速度下离心5～10分钟，使原生质体充分沉淀。 ⑷ 吸去上清液，将沉淀的原生质体悬浮在2ml 0.16mol/L CaCl2·2H2O溶液中。 ⑸ 用注射器向离心管底部缓缓注入12﹪蔗糖溶液6ml，然后离心5～10分。两相溶液界面间应出现纯净原生质体带，管底出现杂质沉淀。 ⑹ 将注射器插入管底，吸出沉淀的杂质。并吸出下部蔗糖液及上部钙液。 ⑺ 用0.16mol/L CaCl2·2H2O溶液悬浮，离心一次，再用培养基如法洗涤一次。 ⑻ 用培养基培养，其操作同叶片原生质体培养。 3．培养结果的观察 ⑴ 活力检查 凡具活力的原生质体均呈现圆球型，在显微镜下可观察到明显的胞质环流运动。在叶肉原生质体中由于叶绿体的阻挡，看不清胞质环流。可取一滴原生质体悬液放在载波片上，加一滴0.1%酚藏花红溶液，凡生活的原生质体均不着色，而死去的原生质体立即染成红色。 ⑵ 细胞壁再生的观察 培养24-48小时后，大部分原生质体已再生新壁，并且体积增大，变成椭圆形。用以下方法均可鉴别细胞壁的再生。 ① 取一滴原生质体培养悬液放在载玻片上，加一滴高浓度（25%）蔗糖溶液，有壁的细胞将发生质壁分离。 ② 取一滴原生质体培养悬液放在载玻片上，加一滴0.01%荧光增白剂溶液。在荧光显微镜下，当用366nm波长的紫外光照射时，细胞壁将发黄绿色荧光。 ⑶ 细胞分裂的观察 培养4天以后，细胞将出现第一次分裂，可在倒置显微镜下观察。在培养8-10天后，应统计分裂频率，即出现分裂的原生质体占成活原生质体的百分率。 一般在细胞团形成后（大约在培养的15-20天），应向培养瓶中补加渗透压稳定剂减半的新鲜培养基，以促进细胞团的增殖。待小愈伤组织形成后，转移到固体培养基上，进行植株分化的条件实验。 五．作业 观察并统计自己游离的原生质体的密度。 六．思考题 1．酶解液及起始培养基为何要保持较高的渗透压？ 2．为什么培养一段时间后，培养基渗透压要降低？
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