1、观察各种不同细胞的形态大小，从而对细胞的分类，进化及分化有所了解。

2、判断和识别光学显微镜下各种细胞器的形态，大小和数目。

3、掌握普通光学显微镜及测微尺的使用方法。

生物种类繁多，形态大小各异．构成生物有机体的最基本结构和功能单位—一细胞山冈其物种、部位和功能不同在形态与大小上呈现一些区别。由于细胞比较小，我们借助于显微镜就可以观测出细胞形态大小的差异。

光学显微镜的最高分辨率为0.2μm，而细胞器大郎分在0.1μm和10μm之间，所以光学显微镜下可见到一股细胞器的外部形态。较大的细胞器和细胞核，质体等还可见到其细微结构。

细胞器往往由特殊物质组成，因而可通过对特异物质的区别染色把各种结构区分开束，每种细胞器都有特殊的形态、大小、分布位置及数目，这也是我们判断。识别细咆器的依据。而每种细胞器在不同细胞、不同发育时期和不同生理状态下的形态大小会有所不同。所以细胞器的观察可用来判断细胞的生理状和发育情况。投们在取材和观察上要注意各种细胞在不同细胞中的特殊性。

1、器材

显微镜、测微尺

2、试剂

Wright溶液：Wright真粉剂0.1g

甲醇60ml

苏木精、硝酸银等

3、材料

真核、原核细胞涂片及切片，动、植物不同组织的切片及新鲜材料（见实验方法中所列)。

  (一)细胞形态与大小的观测

   1、用目镜测微尺分别在高倍镜下和油镜下测量镜台测微尺，从而算出称所用显微镜中目镜测微尺每格所代表的实际长度。

    2、用高倍镜及油镜检测各种切片，并且用目镜测微尺测量细胞和细胞核的长、短径的长度。

    3．选取细胞膜和核膜界限清晰的切片或涂片测量。测量时可旋转目镜（测微尺)及移动载玻片，置被测细胞于测微尺轴线上。

    4．根据测量结果计算各种细胞及细胞核的体积。

①椭球形：

V=4nab²/3

式中：a——长半径

b——短半径

②圆球球：

V= πr²

式中r——半径

③V=πr²h

式中：r——半径

h——高度

 

表1-1实验结果

 

（二）细胞显微结构观察

注意观察下列结构

1、细胞核及核仁

①不同细胞的核和核仁

洋葱根尖切片

黄花菜二倍体与四倍体根切片（示范）

②多核及多核仁现象

百合花药切片

黄花菜四倍体根尖切处

③染色体：洋葱根尖切片

小麦根尖压片（示范）

荻根尖压片（示范）

2、线粒体：洋葱根尖切片，蚕豆根尖切片（Rubins或苏木精染色）

3、叶绿体：水绵新鲜材料临时装片。

由波菜叶片剥下叶肉细胞层，镜检，注意类囊体形态、数目。

4、高尔基体：蚕豆根尖切片（硝酸银或四氧化锇染色）

 

 

1、说明有细胞分化过程中细胞大小相对稳定的原因。

2、绘制细胞显微结构图，把你所见到的各种细胞器绘制在一个细胞内。注意细胞器外形特点，大小，分布位置，数目。

3、查资料回答问题：

某些细胞多核及多核仁的原因。

 

 

了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。

将经细胞放入数种等渗溶液中，由于红细胞对各种溶质的透性不同，有的溶质可以渗入，有的溶质不能渗入，渗入的溶质能够提高红细胞的渗透压，所以促使水分进入细胞，引起溶血。由于溶质透入速度互不相同，因此溶血时间也不相同。

实验用品

一、器材

50ml小烧杯，10ml移液管,试管（1—10cm），度管架。

二、试剂

0.17mol/L氯化钠、0.17mol/L氯化铵、0.17mol/L醋酸胺、0.17mol/L硝酸钠、0.12mol/L草酸铵、0.12mol/L硫酸钠、0.32mol/L葡萄糖、0.32mol/L甘油、0.32mol/L乙醇、0.32mol/L丙酮。

三、材料

羊血

一、羊血细胞悬液

取50ml小烧杯一只，加1份羊血和10份0.17mol/L氯化钠溶液，形成一种不透明的红色液体，此即稀释的羊血。

二、低渗溶液

取试管一支，加入10ml蒸馏水，再加入1ml稀释的羊血，注意观察溶液颜色的变化，由不透明的红色逐渐澄清，说明红细胞发生破裂造成100%红细胞溶血，使光线比较容易透过溶液。

三、羊红细胞的渗透性

1、取试管一支，加入0.17mol/L氯化钠溶液10ml，再加入1ml衡释的羊血，轻轻摇动，注意颜色有无变化？有无溶血现象？为什么？

2、取试管一支，加入0.17mol/L氯化钠溶液10ml，再加入1ml稀释的羊血，轻轻摇动，注意颜色有无变化？有无溶血现象？若发生溶血，记下时间（自加入稀释羊血到溶液变成红色透明澄清所需时间）。

3、分别在另外8种等渗溶液中进行同样实验。步骤同2。

实验结果

将观察到现象列入下表，对实验结构进行比较和分析。

 

不同低渗溶液下的溶血现象

 

   

叶绿体足植物细胞所特有的能量转换细胞器，光合作川就是在叶绿体中进行的。由于具有这一重要功能，所以它一直是细胞生物学、遗传学和分子生物学的重要研究对象。叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，利用低速离心即可分离集中进行各种研究。

    一、通过植物细胞叶绿体的分离。了解细胞器分离的一般原理和方法。

    二．观察叶绿体的自发荧光和次生荧光．井熟悉荧光显微镜的使用方法。

  实验原理将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差迷离心，是分离细胞器的常用方法，一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速度不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮中的颗  粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部．分批收集即可获得各种亚细胞组分。

    叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠或0.4moJ/L蔗糖溶液)中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。将匀浆液在1000r/min的条件下离心2min，以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞。然后，在3000r/min的条件下离心5mia，即可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。分离过程最好在0—5℃的条件下进行：如果在室温下，要迅速分离和观察。

    荧光显微术是利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观察的一种技术。某些物质在—定短波长的光(如紫外光)的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光(如可见光)，这种光就称为荣光．若停止供能荧光现象立即停止。有些生物体内的物质受激发光照射后直接发出荧光，称为自发荧光(或直接荧光)，如叶绿索的火红色荧光和水质素的黄色荧光等。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光称为次生荧光(或间接荧光)，如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。   

    利用荧光显微镜对可发荧光物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间，有必要时立即拍照。另外，在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载玻片，益玻片和无荧光油。

    一、器材

   1、主要设备：普通离心机、组织捣碎机，粗天平、荧光显微镜。

    2、小型器材，500ml烧杯2个，250ml量筒1个，滴管10支，10ml刻度离心管20支，纱布若干，无荧光载片和盖片各4片。

    二、材料

    新鲜菠菜。

    三、试剂

0.35mol/L氯化钠溶O.01%吖啶橙(acridine orange)。

实验方法

 1、选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗及粗脉，称30g于150ml0.35mol/L NaCI溶液中，装入组织捣碎机。

2、利用组织捣碎机低速（5000r/min）匀浆3—5min。

3、将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。

4、取滤液4ml在1000r/min下离心2min。弃去沉淀。

5、将上沾液在3000r/min下离心5rmin．弃去上清液，沉淀即为叶绿体(混有部分细胞陔)。

    6、将沉淀用0.35mol/LNaCI溶液悬浮。

    7、取叶绿体悬液一消滴于载片上，加盖片后即可在普通光镜和荧光显微镜下观察。

    ①在普通光镜下观察。

    ②在荧光显微镜下观察。

    ③取叶绿体悬液一滴滴在无荧光载片上，再漓加一滴0.01%吖啶橙荧光染料，加无荧光盖片后即可以荧光显微镜下观察。

    二、菠菜叶手切片观察

    用剖须刀将新鲜的嫩菠菜切削一斜面置于载片上，滴加1--2滴0.35mol/LNaCI溶液，加盖片后轻压，置显微镜下观察。

    ①在普通光镜下观察。

    ②在荧光显微镜下观察。

    ③用同样方法制片，但滴加I--2滴0.01%吖啶橙染液染色lmin，洗去余液，加盖廾后即町以荧光显微镜下观察。

实验结果

    一、叶绿体的分离和观察

    1、普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。

    2、以Olympus荧光显微镜为例，在选用B(blue)激发滤片，B双色镜和O₅₃₀(orange)阻断滤片的条件下，叶绿体发出火红色荧光。

    3、加入吖啶橙染色后，叶绿体可发出桔红色荧光，而其中混有的细胞核则发绿色荧色。

二、菠菜叶手切片观察

1、在普通光镜下可以看到三种细胞

    (1)表面细胞：为边缘呈锯齿形的鳞片状细胞。

    (2)保卫细胞：为构成气孔的成对存在的肾形细胞。

    (3)叶肉细胞：为排成栅状的长方形和椭幽形细胞。

    叶绿体呈绿色橄榄形，在高倍镜下还可以看到绿色的基粒。

    2、在荧光显微镜下，叶绿体发出火红色荧光，但其荧光强度要比游离叶绿体弱。气孔发绿色荧光，两保卫细胞内的火红色叶绿体则环绕气孔排列成一圈。表皮细胞内叶绿体数量要比叶肉细胞少。

    3、用吖啶橙染色后，叶绿体则发出枯红色荧光，细胞核町发出绿色荧光，气孔仍为绿色。

 

1、在普通光镜下，用目镱测微尺和台镜测微尺测量一下叶绿体的长轴和短轴，分别测重5—10个叶绿体，求其平均值。

2、在荧光显微镜下观察叶绿体的自发荧光时，更换滤片系统，叶绿体的颜色是否有变化?

    3、游离叶绿体和整体细胞内的叶绿体，在荧光显微镜下，具颜色和强度合无差异？

    1、叶绿体分离的实验原理是什么?在分离叶绿体时应注意些什么问题?

    2、普通光镜与荧光显微镜有何异同点?

 

 

一、观察动、植物活细胞内线粒体，液泡系的形态、数量与分布。

二、学习一些细胞器的超活染色技术。

    活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无害毒的一种染色方法。它的目的是显示生活细胞内的某些结构。而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。活染技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理．病理状态。

    根据所用染色剂的性质和染色方法的不同，通过把活体染色分为体内活染与体外活染两类。体内活染是以胶体状的染料溶液注入动。植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的目的。体外活染又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。

活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是染料的“电化学”特性起重要作用。碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表现带有阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，它们彼此之间就发生了吸引作用。但不是任何染料皆可以作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料，而且总是要配成稀淡的溶液来使用。一般足以碱性染料最为适用，可能因为它具有溶解在类脂质(如卵磷脂、胆固醇等)的特性，易于被细胞吸收。詹纳斯绿B(Janus peen B)和中性红(neutral red)两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体和液泡系的染色各有专一性。

一、器材

显微镜、恒温水浴锅、解剖盘、剪刀、罐子、双面刀片、载玻片、凹面载玻片、盖玻片，表面皿，吸管，牙签、吸水纸。

  二、试剂

1、Ringer溶液

氯化钠      0.85g(变温动物用0．65g)

氧化钾      0.258

氯化钙      0.03g

蒸馏水      100ml

2、10%、1/3000中性红溶液

称取0.5g中性红溶于50ml Ringer液，稍加热(30—40℃)使之很快溶解，用滤纸过滤，装入棕色瓶于暗处保存，否则易氧化沉淀，失去染色能力。

临用前，取已配制的1％中性红溶液．取l呢原液lml，加入29ml Ringer溶液混匀，装入棕色瓶备用。

3、l%、1/5000詹纳斯绿B溶液

称取50rug詹纳斯绿B溶于5mi Ringer溶液中．稍加微热(30—40℃)，使之溶解，用滤纸过滤后，即为1%原液1mI，加入49ml Ringer溶解，即生1/5000工作液装入瓶中备用。最好现用现配，以保持它的充分氧化能力。

三、材料

 1、小白鼠肝细胞。

 2、人口腔上皮细胞。

3、洋葱磷茎内表皮细胞。

4、蟾蜍胸骨剑突软骨细胞。

5、小麦或黄豆幼根根尖。

一、线粒体的超活染色与观察

    线粒体是细胞进行呼吸作用的场所，具形态和数量随不同物种、不同组织器官和不同的生理状态面发生变化。

    詹纳斯绿B是毒性较小的碱性染性，可专一性地对线粒体进行超活染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态(即有色状态)，呈蓝绿色：而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原为无色的色基(即无色状态)。

    (一)人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色观察

    1、取清洁载玻片放在37℃恒温水溶锅的金属板上，滴2滴1/5000詹纳斯绿B染液。

    2、实验者用牙签宽头在自己口腔颊粘膜处稍用力刮取上皮细胞，将刮下的粘液状物放入载玻片的染液滴中，染色10-15min(注意不可染液干燥，必要时可再加滴染液)，盖上盖玻片，用吸水纸吸去四周溢了的染液，置显微镜下观察。

    3、在低倍镜下，选择平展的口腔上皮细胞，换高倍镜或油镜进行观察。可见扁平状上皮细胞的核周围胞质中，分布着一些被染成蓝绿色的颗粒状或短棒状的结构，即是线粒体。

    (二)小自鼠肝细胞线粒体的超活染色观察

    1、用颈椎脱臼法处死小白鼠，置于解剖盘中，剪开腹腔，取小白鼠肝边缘较薄的肝组织一小块，放入表面皿内。用吸管吸取Ringer液，反复浸泡冲洗肝脏，洗去血液。

    2、在干净的凹面载玻片的凹穴中，漓加1/5000詹纳绿B溶液，再将肝组织块移入染液，注意不可将组织块完全淹没，要使蛆织块上面部分半露在染液外，这样细胞内的线粒体酶系可充分得到氧化，易被染色。当组织块边缘被染成蓝绿色即成(一般需染20--30min)．

3、吸去染液，滴加Ringer溶液，用眼科剪将组织块着色部分剪碎，使细胞或细胞群散出。然后，用吸管吸取分离出的细胞悬液，滴一滴于载玻片上，盖上盖玻片进行观察。

4、在低倍镜下选择不重叠的肝细胞，在高倍镜或油镜下观察，可见具有1--2个核的肝细胞质中，有许多被染成蓝绿色的线粒体，注意其形态和分布状况。

(三)洋葱鳞茎表皮细胞线粒体的超活染色观察

 1、用吸管吸取1/5000詹纳斯绿B染液，滴一滴于干净的载玻片上，然后，撕取一小片洋葱鳞茎内表皮，置于染液中，染色10--15min.

2、用吸管吸去染液，加一滴Ringer液，注意使内表皮组织展平，盖上盖玻片进行观察。

  3、在高倍镜下，可见洋葱表皮细胞中央被一大液泡所占据，细胞核被挤至一侧贴细胞壁处．仔细观察细胞质中线粒体的形态与分布。

二、液泡系的超活染色与观察

中性红为弱碱性染料，对液泡系(即高尔基体)的染色有专一性，只将活细胞中的液泡系染红色，细胞核与细胞质完全不着色，这可能是与液泡中某些蛋白质有关。   

(一)蟾蜍脚骨剑实软骨细胸的液泡系中性红染色观察软骨细胞能分泌软骨粘蛋白质和胶原纤维等，因而粗面内质网和高尔基体都发达，用中性红超活染色可明显地显示出液泡系。

1、将蟾蜍处死，剪取胸骨纠突最薄的部分一小块，放放载玻片上的1/3000中性红染液滴中，染色5--10min。

2、用吸管吸去染液，滴加Ringer液，盖上盖玻片进行观察。

    3、在高倍镜下，可见软骨细胞为椭圆形，细胞核及核仁清楚易见，在细胞核的上方胞质中，有许多被染成玫瑰红色大小不一的泡状钵．这一特定区域叫“高尔基区”，即液泡系。

（二）小麦根尖细胞液泡系的中性红染色观察

1、实验前，把小麦种子或黄豆培养在培养皿内潮湿的滤纸上，使具发芽，胚根伸长到lcm以上．

2、用双面刀得把初生的小麦或黄豆幼苗根尖(1-2cm)小心切一纵切面，放入载玻片上的1/3000中性红染液滴中，染色5一10min。

3、吸去染液，滴一滴Ringer液，盖上盖玻片，并用镊子轻轻地下压盖玻片，使根尖压扁，利于观察。

4、在高倍镜下，先观察根尖部分的生长点的细胞，可见细胞质中散在很多大小不等的染成玫瑰红色的圆形小泡，这是初生的幼小液泡。然后，由生长点向延长区观察，在一些已分化长大的细胞内，液泡的染色较浅，体积增大，数目变少。在成热区细胞中，一般只有一个淡红色的巨大液泡，占据细胞的绝大部分，将细胞核挤到细胞一侧贴近细胞壁处。

从以上的观察结果，想想标题物细胞液泡系的形态演进情况。

一、绘口腔上皮细胞示线粒体形态与分布。

二、绘蟾蜍脚骨剑突软骨细胞示液泡系形态与分布

1、用一种活体染色剂对细胞进行超活染色

2、小麦或黄豆根尖经中性红超活染色，为什么看到生长点的细胞中液泡多，而且染色深，伸长区细胞中液泡数量变少，染色浅?

3、高等动物和高等檀物细胞中的液泡系(高尔基体)分布上有何不同?

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

细胞膜是双层脂镶嵌蛋白质结构，脂和蛋白质又能与糖分子结合为细胞表面的分枝状糖外被。目前认为：细胞间的联系，细胞的生长和分化，免疫反应和肿瘤发生都和细胞表面的分枝状糖分子有关。

 凝集素(1ectin)是一类含糖的(少数例外)并能与糖等专一性结合的蛋白质，它具有凝集细胞刺激细胞分裂的作用。凝集素使细胞凝集是由于它与细胞表面的糖分子连接，在细胞间形成桥的结果，加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞的凝集。

1、土豆块茎。

2、显微镜、粗天平、载玻片、滴管2支、离心管2支。

3、PBS缓冲液

称取NaC 17.2g、Na2HP04 1.48g、KH2PO40.43g、加蒸馏水，定容至1000ml调pH值到7.2。

4、2％的红细胞。

以无菌方法抽取兔子静脉血液(加抗凝剂)，用生理盐水洗5次，每次2000r/min，离心5min，最后按压积红细胞体积用生理盐水配成2%红细胞液。

称取土豆去皮块茎2g，加10ml PBS缓液，漫泡2h，浸出的粗提液中含有可溶性土豆凝集索。

用滴管吸取土豆凝集素和2%红细胞液各一滴，置载玻片上，充分混匀，静置20min后于低倍显微镜下观察血球凝集现象。

3、以PBS液加2%血细胞液作对照实验。

简图表示血细胞凝集原理。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

学习DNA的—Feulgen染色方法，了解反应原理。

DNA经弱酸(1mol/LHCI)水解，其上的嘌岭碱和脱氧核糖之间的键打开，使脱氧糖的一端形成游离的醛基，这些醛基在原位与Schiff试剂(无色晶红亚硫酸溶液)反应，形成紫红色的化合物，使细胞内含有DNA的部位呈紫红色阳性反应。紫红色的产生，是由于反应产物的分子内含有醒基，醌基是一个发色团，所以具有颜色。对照组预先用热三氯醋酸或DNA酶处理，抽提去细胞中的DNA而得到阴性反应，从而证明了Feulgen反应的专一性．

一、材料

1、Camoy液固定的鼠肝石蜡切片。

2、Camoy液固定的洋葱根尖或根豆根尖切片。

二、试剂

1、Camoy固定液

3份95％酒精加入1份冰醋酸。

2、l mol/LHCI

取比重1.18的浓HCI82.5ml，加水至100ml。

3、Schiff试剂

先将200mi蒸馏水煮沸，由火上取下，加入碱性品红1g，充分搅拌，有助于溶解．待溶液冷到50℃时。过滤到磨口棕色试剂瓶中。加入1mol/L HCI  20ml，冷却到25℃时加入1g偏亚硫酸钾（K₂S₂O₂）或偏亚硫酸钠（Na₂S₂O₅）充分振荡后盖紧瓶塞,放于暗处过液。次口取出，呈淡黄色或近于无色，加中性活性炭一匙，约0.5g，剧烈振荡1min，过滤后即得无色品红。

4、亚硫酸水溶液（漂白液）

100%偏重亚硫酸钠水溶液5ml，蒸馏水100ml，1mol/L HCI5ml，摇匀，塞紧瓶塞。

5、5%三氯醋酸

6、0.5%固绿酒精溶液（95%酒精溶液）

实验方法

石蜡切片

溶蜡二甲苯I

溶蜡二甲苯II             （3-5min）

1/2纯酒精+2/2二甲苯      （3-5min）

纯酒精I                   （3-5min）

纯酒精II                  （2-3min）

95%酒精                    （2-3min）

83%酒精                    （2-3min）

 

1mol/L HCI               60℃8-15min(水浴或温箱中)

Schiff试剂               （60-90min）

亚硫酸水（I II III）       （各5 min）

流水冲洗                （5-15min）

蒸馏水

0.5%固绿水溶液（复染）  （1min）（此步要快，以免过染）

蒸馏水

70%酒精

83%酒精

95%酒精

纯酒精I 

纯酒精II

纯酒精III

透明二甲苯I

透明二甲苯II

封 面

（贴上标签，注意材料，反应名称，作者姓名及日期）

显微镜下检查：

实验组：细胞核呈现紫红色

核仁及细胞呈现绿色

对照组：由于DNA被提取破坏

所以细胞核无紫红色

1、验交Feulgen反应制片1张

2、简图表示Feulgen反应的染色结果

3、说明Feulgen反应中设立对照组的必要性。

 

一、实验目的

掌握PAS(高碘酸-希夫试剂）反应显示多糖的方法了，了解多糖在细胞内的分布及其特性。

    此法的基本原理是利用高碘酸(氧化剂)破坏多糖分子中的C-C健，变为醛基，此醛基与希夫试剂(无色品红亚硫酸溶液)反应，生成一种紫红邑的反应产物。这一过程称为PAS反应。

表现PAS阳性反应的物质，除多糖外，还有糖蛋白及粘蛋白等，后二者是糖类化合物与蛋白质的络合物．上述成分与高碘酸—希犬试剂反应即生成正反应的红色产物。其生成物可得到定性的定位测定。

方法

1、试剂的配制

(1)0.5--0.8%高碘酸(HIO4）水溶液

(2)希夫试剂

将1克碱性晶红溶于200毫升沸腾的蒸馏水中，摇动5--10分钟，冷却到50℃时过滤．向滤液中加入1NHCl20毫升，冷至25℃，加2克偏亚硫酸钾(或钠盐),摇匀，静置暗处过液．加活性炭2克，摇动2--3分钟，用滤纸将溶液过滤于棕色瓶中．滤液应该是无色或淡黄色，若呈红色则不能用。用前将染液升到室温。根据我们的经验：使偏亚硫酸钾2--3倍于碱性品红，可增强希夫试剂活力。在提高偏亚硫酸钾用量的情况下，即可使碱性晶红变成无色，不用活性炭去色过滤。

（3）洗涤液——偏亚硫酸钾(或钠)溶液

10％偏亚硫酸钾    5毫升

INHCl             5毫升

蒸馏水            90毫升

临川时将三者混合，使用新鲜混合液。

2、实验程序

(1)切片脱蜡后，经各纯浓度酒精下降至蒸馏水

(2)流水冲洗15--30分钟．

(3)0.5—0.8％高碘酸溶液处理10分钟．

(4)流水洗涤5--10分钟，蒸馏水过一下．

(5)移入希夫试剂中20--30分钟．

(6)用偏亚硫酸钾溶液洗三次，每次2--3分钟。

(7)流水洗涤10--15分钟，并通过蒸馏水5分钟．

(8)按常规通过各级乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封片。

对照片：切片通过第二步后，分别经以下处理．然后与正反应并列进行。

a)1％淀粉酶，25℃处理1小时．

b)10％醋酸酐的吡啶溶液中，室温下4-2小时，

c)用唾液37℃下消化处理30分钟，更换一次。

3、结果

淀粉粒、纤维素细胞壁及细胞内的一些中性粘多糖、粘蛋白及糖蛋白被染紫色。

作业

交PAS反应玻片一张。

 

 

 

学习用光用显微镜观察植物细胞内骨架的基本方法

了解植物细胞的骨架的结构特征．

 当用适当浓度的Triton X-100处理时，可将细胞内蛋白质破坏，但细胞内骨架系统的蛋白质却被保存，后者有考马斯亮蓝R250染色，可在光学是显微镜下观察到细胞骨架的网状结构。

(一)材料

洋葱鳞茎

(二)器材

显微镜，5ml烧杯，胶头滴管，容量瓶、试剂瓶、载玻片、盖玻片、镊子。

试剂

（1）M-缓冲液：50mmol/L味唑、50mmol/L KCJ、0.5mmol/LMgCl₂、mmol/L EGTA 、0.1mmol/LEDTA、1 mmol/L巯基乙醇。

（2）6mmol/L pH6.8磷酸缓冲液，用NaHC03调pH)。

（3）1%TritonX-1OO，用M-缓冲液配制。

（4）O.2%考马斯亮蓝R250，其溶剂是：甲醇46.5ml，冰醋酸7ml、蒸馏水46.5ml。

（5）3％戊二醛，用磷酸缓冲液配。

（6）50％、70％、95％乙醇。

（7）叔丁醇。

（8）正丁醇。

（9）二甲苯。

（10）中性树胶。

四、实验方法

（1）撕取洋葱鳞茎内的表皮缅胞（约1cm2大小若干片）置于装有pH6.8磷酸缓冲液的5ml烧杯中，使其下觉。

（2）吸去磷酸缓冲液，用1%Triton X-100处理20-30分钟。

（3）吸去Triton X-100,用M-缓冲液洗三次，每次10分钟。

（4）3％二醛固定0.5--1小时．

（5）pH6.8磷酸缓冲液洗三次，每次10分钟。

（6）0.2％考马斯亮蓝R250染色20--30分钟，

（7）用蒸馏水洗1--2次，细胞置于载玻片上,加盖玻片，于普通光学显微镜下观察。

（8）如观察装什效果好，可制作成永久装片．

在样品的5mt烧杯中，按顺序通过如下药物：50％乙醇、70％乙醇，90％乙醇、1/295％7醇+1/2叔丁醇、叔丁醇(每级5--10分钟)；或正丁醇→二甲苯→二甲苯→二甲苯(每级5--10分钟)，然后捞取样品，平展于载玻片上，经镜检，效果好，可加一滴中性树胶，盖上盖玻片。

作业

绘一个洋葱磷叶表皮细胞的细胞骨架图

 

 

 

 

 

 

学习植物染色体标本的制备技术，掌握染色体的计数方法，了解染色体的生物学意义．

实验用品

一、材料

大麦、黑麦或小麦种子

二、试剂

1、Camoy固定液

2、O.1％秋水仙素溶液

3、lmol/L HCl

4、Schiff试剂

5、亚硫酸水溶液(漂洗液)

6、混合酶液(纤维素酶，果胶酶各1％--2％)

7、Carbor fuchsin(卡宝晶红)染液

配方I：

原液A：称取38碱性晶红，溶于100ml 70％酒精中(此液可无限期保存)。

原液：B取10mi原液A，加入90ml 115％石炭酸(苯酚)水溶液(两周内使用)。

染色液：55ml原液B加6ml冰醋酸和6ml 37%甲醛(此液适用于植物原生质体培养中细胞核和按分裂的染色)．

配方II：

取配方I中的染色液2--10ml，加90—98ml45％醋酸和1.8g山梨醇(此液适用于核和染色体的一般形态观察，具有广泛的适用性)。

I、取材：将大麦、黑麦或小麦种子培养在培养[阻内的漫滤纸上℃下发芽，特胚根长达I--2cm时，切取0.5cm长的根尖部分。

2、预处理；将切下的根尖浸入0.1％秋水仙素液中，室温下处理3--4h。也可把根尖浸入小烧杯内的自来水中，杯内加冰两小块，置0--4℃冰箱内低温处理24h左右。

3、固定：取出根尖，投入Carnoy液中固定2-24h，换入70%酒精，暂时保存。

4、水解：把根尖投入预热的58-60℃ 1mol/L热HCI中，恒温条件下水解14-15min。

5、染色：倒去热HCl，滴加Schiff试剂(五色晶红)少许，染色0.5--1h(也可在冰箱内染色12--24h)。

6、漂洗：吸去Schiff试剂，用漂洗液换洗2--3次，每次1--2min.

7、酶解：在载玻片上切取根尖着色深的部分，浸入小酒杯内1--2滴混合酶液中，室温下酶解40min左右或在28℃温箱中酶解20min左右。

 8、洗涤：吸去酶液，加蒸馏水，用吸管换洗几次，除去残留酶液后加入45%醋酸。

9、压片：用吸管从醋酸中吸取材料，置干净载玻片上，材料周围保留半滴45％醋酸，盖上盖玻片。其上放一片吸水纸．左手揩压住吸水纸的左边。右手指从吸水纸的左端向右方轻轻抹去，再用铅笔擦头从盖片上轻轻敲打，使细胞均匀散开。

10、镜检；把压好的片于放显微镜下，先观察细胞分散状况和中期分裂相的多少，再检查分裂中期细胞中的染色体是否完全敞开．如若染色体分散不好而难以分辨和计数。可取下片子，平放桌面上，用手指隔着吸水纸在盖玻片上稍施压  力，如果操作细心，用力适度，便可很容易得到染色分散良好的压力标本，供观察，计数和照相用。

11、封存：压好的片子如果来不及观察或照相，必须进行暂时封存。封存时

先在盖玻片四周各放麦粒大石蜡一块，然后用烧热的解剖针迅速熔化石蜡，使盖片四周严密封闭．封好的片于可放培养皿内湿滤纸上的火柴棒支架上，盖上培养皿，可放冰箱内保存2—3天．

Schiff试剂染色效果不够理想的材料，可于水解后改用Cart)orfuchsin染色(5-5rain)。由于Carbor fuchsin具有染色快、着色深以及适用性广等特点，因此多数植物的根尖、幼芽、花药以及培养的细胞或愈伤组织，经Carbor fuchsin染色，都能得到良好的结果。

作  业

验变压片标本1-2张，要求细胞分散均匀，形态完整，中期分裂相中染色体数目齐全，互不重叠能够进行准确计数和照相。

 

动物的游离细胞以及植物成微生物去壁后的原生质体，在电刺激下进行细胞融合，且融合率高、无毒性，操作简便及融合后的细胞继续培养成活率高等优点，是细胞工程手段的又一进展。

 

将制备的游离细胞或原生质体，置于电融合室中，在高频交流电场的作用下，细胞被极化，成为偶极子，造成细胞之间相互连接，如果施加的高频交流电压(即正弦波的p-p值)过高或作用时间过长，则细胞连接成串珠状，应适当控制以上条件，尽量使两细胞处于点接触状态，然后施加方波脉冲予以刺激，由于电脉冲的瞬间作用，可击破两细胞接触点部位的质膜，此时质膜的脂类分子发生重组，同时由于细胞表面的张力作用，使两细胞融合逐步完全。

 

一、仪器

JCF-I型细胞电融合仪、细胞融合池、普通离心机、倒置显微镜(或研究用显微镜)，刻度吸管、不锈钢网(200目)、镊子、解剖刀、解剖剪、注射器、毛细吸智、刻度吸蕾。小烧杯(10m1)、滴瓶、培养皿、毛笔等。

二、药品

甘露醇、氧化钠，纤罐索醇(Onozura R-10)、离析酶(Macerozyme R-10)、蜗牛酶(中科院生物物理所产)、CaCl_2、2H₂O、MES (2-N-吗啉乙烷磺酸)、葡聚糖硫酸钾等。

三、材料   

如果只观察细胞的融合过程和掌握融合方法，本实验所有步骤均可在有菌条件下操作。

一、植物原生质体的制备

1、取幼嫩的叶片或充分展开的子叶，先用水洗净并吸去表面的水份，再置入小烧杯中将叶片剪成碎块。

2、将碎块放入1.5％纤维素酶、0.3％离析酶、0.5％蜗牛酶、0.6mol/L甘露醇、50mmol/L CaCl2·2H₂0、MES 3mmol/L、葡聚糖硫酸钾0.3％，pH5.6的酶液中，置于25℃暗处游离5h(或15℃过液)，游离时间结束时，可镜检原生质体分离情况，如果大多数原生质体还未从组织中释放出来，需增加在酶液中的游离  时间。新出厂的酵在5h内一般就可将原生质体游离出来，但因药品质量问题或存放时间过长，致使酶活力下降，要适当延长酶解时间。

3、将醇解出来的原生质体用不锈钥网过滤，以除去未被酶解的组织，过滤后用0.6M的蔗糖冲洗网上残留的原生质体，然后以200r/min进行离心处理5min。

4、用带长针头的注射器吸去上清液，然后加入1—1.5ml 0.2mol/L的CaCl·2H₂O，将原生质体混匀。

5、用细头滴管或带长针头的注射器向管底慢慢注入20％的蔗糖液，再以300r/min离心10min，此时可见到在上下两液体间的界面处有一层乳白质的带状物，即为纯净的原生质体，其破碎的部份及其它杂质都沉降到离心管底部，用长针头注射器或毛细吸臂分别吸去管底的杂质和蔗蔗糖液以及原生质体上层的  CaCl₂液．

6、向离心管加入2ml 0.2mol/L的CaCl·2H2O溶液，混匀后以300r/min离心5min去掉上清液，量后用0.6mol/L的甘露醇溶液稀释并调整每毫升含5×10⁴个原生质体。

二、动物细胞的制备

用灭菌的注射器先吸入Alsver液(葡萄糖2.05g，枸椽酸钠0.88，NaCl0.42g，加重蒸水至100mil）lml，再从鸡的翼下静脉取血0.5--1ml，取出后放入刻度离心管中，再加入2--3ml Alsver液，使总量为4--5ml，混匀并封口，置于4℃冰箱内可供一周内使用，实验时取贮备的鸡血细胞lml，加入4ml85％生理盐水，混匀后以1200rr/min离心5min，去上清液后，最后用0.6mol/L的甘露醇液(或0.6mol/L蔗糖溶液)混匀后以上述离心条件洗涤两次，最后用0.6mol/L的甘露醇液将鸡细胞稀释并调整成每毫升含2×10⁵个。

如采用传代培养的骨髓或腹水瘤细胞，可先用0.9％的生理盐水洗涤两次，离心速度为800--1000r/min，每次5min，再用0.6mol/L的甘露醇或蔗糖液洗涤两次，每次600--800r/min，离心5min，最后用甘露醇调整成每毫升含瘤细胞1×10⁵个。

三、细胞电融合方法

1、仪2S结构和使用方法

JCF-型细胞电融事仪的各项技术参数是通过大量的融合实验数据，并参考岛津公司(日)SSH型电融合装置的参数值而设计的．当打开电源，指示灯亮，并拨通输出开关和正弦输出开关，选择和按下正弦频率按键(共分为0.6、0.8、1.3、1.5MHz五档)，此时将输出电缆与示波器相接，在示波器上即出现高频正弦波形，当左右旋转正弦幅度旋钮，则正弦电压的p-p值，也随之降低和升高，如果将输出电缆与电融合室相接，则细胸相互连接．此时再旋动正弦幅度(即正弦电压)旋扭，则仪器上电压表指针随之升高和降低．如果正弦电压过高，则细胞连接速度加快，并呈串珠状，不利于两细胞融合。

将正弦输出开关搬至“复合输出”档，根据所需功率大小选拔复合输出I或、II档、I档为低功率，II档为高功率；再根据实验要求，选择并按下你所需要的“脉冲宽度”拨键(分1ms，0.2ms、0.1ms、10ms、1us五档)和“脉冲幅度”按键(50V、100V、150V、200V、250V五档)，还配有脉冲幅度旋扭(细调)，调整范围0-50V，可使每档增值50V。

施加脉冲刺激可分为“自控”和“手控”两档，当使用“自控”输出脉冲时，先将开关搬向自控档，然后根据需要选择并按下“脉冲频率按健”(分为2sl次及每秒1次、2次、5次、l0次共五档)，即可自动发送电脉冲；如果将开关搬至“手控”档，需按动“手控”按扭，每按动一次发送一个脉冲。无论自控或手控输出，每个脉冲输出都伴有报鸣音响，将输出端与脉冲示波器连接，则可观察到由脉冲宽度、幅度及脉冲间隔所构成的示波图像，当改变以上有关参数值时，其图像亦发生变化：把开关搬向反向，则产生负脉冲，当脉宽和幅度等值不变时，其图像与正脉冲波形相同，但方面相反，上下对称．将电缆输出端与电融合室的两电极相接，并按上述要求发送一定方波脉冲，细胞受到电刺激后，可产生融合。

2、电融合操作

植物原生质体融合

(1)开启电源，关闭“输出开关”，将开关搬向正弦输出档，此时可根据实验需要，将正弦额度选择在1—1.3MHz，脉冲宽度为0.1ms或)10μs，脉冲幅度为150V，脉冲频率为1次/s，并依次按下各标定按键，最后调整正弦电压(即正弦幅度)旋扭，使电压表处于5-10V处。

(2)将电融合池内两电极距离调整成1-1.5mm，并用毛细吸管吸取制备的原生质体悬液约0.1-0.2ml置融合池中，盖上盖片，注意在融合池中，特别是在两电极间不能容有气泡。

 (3)净融合池置于显微镜载物台上，并将两电极的精出端与仪器的输出电缆接通，然后用低倍镜(10×10)找出融合室中央两电极间的焦面，此时可观察到原生质体呈平均分布状态，互不接触。

(4)打开输出开关，原生质体在高频交流电场作用下，迅速按电极垂直方向排列，此时应控制正弦电压大小，如果原生质体接触缓慢，可适当提高正弦电压：如果原生质体间接触过快，应立即降低电压，否则相互接触的原生质体很快会连接成串珠状。

(5)选择两个相互接触的原生质体，并转向高倍镜(1OX40)观察(图1)，将开头搬向复合输出，然后将控制开关搬向“自控”档，此时会按给定的频率发出连续脉冲，每一脉冲都伴有报鸣音响，两原生质体每接受一次脉冲刺激后，在视野中可观察到产生轻微颤动，当连续发送5-10个脉冲刺激后，约30s内可观察到两原生质体接触点处的质膜被击破穿，并开始融合(图2)，经过7至10几分钟，原生质体逐步融合(图1)，当融合的两细胞变成一个圆球形，融合过程结束(图2)，如果此时再观察电融合室中两电极间其它部位，由于原生质体大小的不同决定其表面张力及其膜特性的差异，可观察到有的已融合完毕，有的正在融合之中，即两原生质体有的呈哑铃状，有的呈长圆形或卵圆形。

 动物细胞融合的融合方法及条件基本同上，但因动物细胞的膜结构(特别是红细胞膜)比原生质体具有更大的电刺激耐受性，因此要造成细胞接触点处的膜击穿，需要适当加大脉冲电压，脉冲宽度或增加刺激次数，通常在做动物细融合时，当电极距离在1-1.5mm范围，可将脉冲电压调到200-250V，脉冲宽度调至0.1ms，电刺激次数为10-15次；如果以鸡红细胞为融合材料，当施加以上电刺激参数后，可在显微镜下观察到很多的双按体细胞。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

附一  影响细胞融合的因素

一，用于供原生质体或动物细胞悬浮的介质，必须满足两个条件：一是为了保持细胞的生物活性，使融合后的细胞能继续存活，并通过培养能继续分裂和分化，其介质要求与细胞本身具有等渗性；二是为了保证融合之前所施加的各项电参数充分发挥作用，其介质应具有高纯度的非离子溶液，如果在溶液中存在Na⁺、 K⁺、Ca²⁺等金属离子或Cl离子，将使介质的导电性增加，当施加脉冲波刺激时，据报导，其总能量Q将通过离子的传导作用损失80％以上，而直接通过细胞，用于击穿膜接触点使其细胞融合的能量仅占10—20%，当有离子存在并使电脉冲能量高度损失的情况下，将不能保证细胞进行融合。

在介质中有金属离子存在，当施加高频正弦波电场时，不能将细胞极化成偶极子，从而不能使细胞间相互接触和连接，更谈不上细胞间相互融合。

为了解决以上存在的问题，一是采用高纯度的蒸馏水(三蒸水或四蒸水)来配制介质，二是选用适当的非电介质溶质．如甘露醇、山梨醉或蔗糖等来配制供细胞悬浮的等渗溶液，另外，在清洗电融合室时，以要以高纯度的蒸馏水用毛笔擦净。

二、在做原生质体融合时，其原生质体游离的状况对完全细胞融合至关重要，游离出好的原生质体应具有折光性强，呈饱满的球状体，质膜与细胞质无明显界限，此种原生质体在电刺激下很易融合．当观察到原生质体不呈现球状体，且折光性差，呈暗褐色，细胞的质膜部位有一层较厚的膜状物，这与游离过程脱壁不净有关，此种原生质体在电刺激下很难产生融合，如果继续加大各项电参数刺激，则细胞被击破。

三、根据近几年国外报导，在细胞悬液中加入链霉蛋白酶E (pronase E)，可改变细胞膜结构，并增强膜活性，按每毫升l-3mg配制，能使细胞融合率增高，我们利用0.6mol/L的甘露醇液配制成每毫升含pronae E lmg做为细胞悬液，然后按每毫升含红细胞2×10⁵个，在37℃下温育30min，然后按原定各项电参数进行电融合，通常以GXN液作为稀释剂，一般使用浓度都在50％左右，对细胞的毒性作用较大，虽然在融合后马上进行洗涤，但融合后经过培养阶段，融合细胞的存活率仍然很低．我们的实验证明，如果在0.6mol/L的甘露醇作溶剂，配制成6％--8％的PEG（Mw=000）作为细胞悬液，再按上述条件进行电融合实验，其融合速度和融合事与不加PEG相比都有提高．

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

附二  利用聚乙二醇(polycthyleneglycol，简称PEG)

为媒介物进行细胞融合

一、实验目和的原理

    掌握利用聚乙二醇为介导物对各类细胞的融合方法．当前普遍认为聚乙二醇

  分子能改变各类细胞的腆结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，使细胞发生融合。

   二、溶液配制

    1、Alsver液(同前)

    2、0.85％生理盐水液

    3，GXN液

NaC l8g、KCl0.4g、Na2lOP04·2H201.77g、NaH2P04·H2O0.69g，葡萄糟2g，酚红（phenolrad）0.01g，溶于1000ml重蒸水中。

    4、50％PEG液

    实验前临时配制，根据需要称取定量PEG(Mw=4000)，放入刻度试管或刻度离心管内，在沸水浴中加热，使其熔化，如做细胞培养融合实验，可用高压蒸汽灭菌30min，待冷却至50℃时，加入预热至50℃等体积的GKN液，混匀。

   三、融合方法

    1、取制备的鸡红细胞(制备方法同前)悬液lml，加入4min0.85％生理盐水，混匀后以1000-1200r/min离心5min，去上清液后．再以上述条件离心洗涤两次(5min、10min)，如果采用各种瘤细胞，只将洗涤液改为0.9的生理盐水，其它条件同上。

    2、将最后一次离心沉降的鸡虹细胞或有关瘤细胞（去上清液）加入2—3mlGKN液，混匀后待用。

3、取以上悬液，用血细胞计数法计数，再以GKN液将鸡红细胞稀释成每毫升含2×10⁵个，瘤细胞每毫升含1.5×l0⁵个。

4、如做同种细胞间融合，可取有关细胞悬液1ml,加入50%的PEG液混匀，置于30℃水浴内温育lO-15min；如采用异种细胞融合(如鸡红细胞与腹水瘤细胞)，可分别取0.5ml，再加入0.5miGKN液一起混匀，其它步骤同上。

5、用吸管或移液器吸取以上细胞悬液0.1--0.2ml，滴在薄底小培养皿中，利用倒置显微镜进行观察。

四、结果

在倒置显微镜下可观察到由同种细胞融合形成的细胞，称为同核体 (homokaryons)，利用不同亲本的不同细胞彼此融合所形成的细胞，称为异核体 (heterokaryons)，还可观察到3个以上细胞融合在一起的合胞体。

细胞融合率系指在显微镜的视野内，已发生融合的细胞其细胞核总数与该视野内所有细胞(包括已融合的细胞)的细胞核总数之比，称为融合率，通常以百分比表示，而且要进行多个视野测定，再加以平均统计，更为准确。

作  业

1、绘图表示所观察到的融合细胞．

2、请写出细胞电融合的注意事项．

思考题

1、说明细胞电融合的原理．

2、在细胞电融合中，设对细胞产生可逆性电击穿的总能量为Q，如何理解各项电参数之间及其与Q值的关系?

综合大实验

一石蜡切片法

 

目的要求

了解石蜡切片法的整个过程，初步掌撑石蜡切片技术。

材料及用具

(一)材料：选择适用于石蜡切片的根，茎、叶、芽、子房、花药做材料。

(二)用具：恒温箱、弓字板、镊子、刀片、解剖刀，切片机、切片刀，毛笔、牛皮纸、染色缸、培养皿、石蜡熔点(51—54C)、载玻片、盖玻片。

(三)药品：固定剂、各级浓度酒精、二甲苯、l％番红水溶液、半自动显微镜技术0.2％～0.5％亮绿精液、0.5％苏木清液、2％铁明矾液，粘贴剂，中性树胶等。

操作过程

1、取材：切取新鲜材料数段，每段3-4毫米：

2、固定：用于观察组织的材料，入FAA液固定24小时，用于观察细胞分裂的材料，入桑弗利斯固定24小时；

3、冲洗：用FAA固定的材料，用70%酒精洗3次，每次2小时，用桑弗利斯固定的材料，用流水冲洗24小时，然后经30%、50％、70%，的酒精中脱水，每级半小时至1时。

4、脱水：材料经80%、95％、100%、纯酒糟中，继续脱水，每级半小时至1小时。

5、透明：入纯酒精+二甲苯+二甲苯，每级半小时至2小时。

6、浸蜡：已透明材料→二甲苯+石蜡，在35℃左右的室温中浸蜡1-2天，然后移入纯石蜡中(放入56℃恒温箱内)每隔半小时更换纯蜡一次，约换纯虹2-3次，即可进行包埋。

7、包埋：先用牛皮纸折成适当大小的纸盘，放在用酒精灯加热的弓字板上，然后从温箱中取出盛有石蜡和材料的小杯，放在弓字板上，同时从温箱中取出已熔解的石蜡，迅速倒入纸盒里，并将石蜡杯放回温箱，将熔解的石蜡保存备用，再用烤热的镊子将材料从小杯中移入纸盒内，并使材料间隔开来，排列整齐，然后将纸盒轻轻放入冷水中，待表面石蜡凝结后，将纸盒沉入水中，约20分钟后，取出撕去纸盒，将蜡块保存。

8、切片：先将蜡块沿两个材料之间切开，并将带材料的小蜡块，根据切片的方向，修整成矩形，然后用荡片器将小蜡块固着在小木块上，用旋转切片机将蜡块切成连续的蜡带，其厚度为10-12微米，将蜡带放在黑色蜡光纸上，使蜡带正面朝上。

9、粘片：在洁净的载玻片上，滴上一层粘片剂，将分割的蜡片，浮载于粘片剂上(使反面朝下)，置温台上加热，使蜡片平展，然后吸去多余的粘片剂，将蜡片排列整齐，把载玻片平放木板上，放入30℃的温箱中烘片2小时。

10、染色：任选一种进行。

甲：用番红与亮绿染色法

(1)切片入二甲苯中，约10分钟左右，使石蜡完全溶去；

(2)入纯酒精与二甲苯等量混合液中5分钟：

(3)经100％，95％，70％，50％酒精下降到水；

(4)用I％番红水溶液染色2-12小时：

(5)用水洗去多余染液；

 (6)脱水：经50％酒精一70％酒精，各5分钟：

 (7)用0.2％亮绿染色2-3分钟；

二  半自动显微镜摄影技术

 

目的要求

了解半自动显微摄影机的基本结构，学会显微摄影的操作方法。

材料与工具

(一)材料：动、植物切片标本

(二)用具：显微镜、旁视式显微摄影装置，EMM-7型光电测光表、电压调节器。

实验内容

(一)黑白胶卷显微摄影的操作步骤

1、打开电压调节器电源开关，调节电源电压，使光线强度适当；

 2、将切片标本置于载物台上，进行显微镜调焦。使物象清晰；

 3、将显微镜光路选择杆拔至绿档(CV)，使光源的80％的光线进入显微摄影装置，20％的光线进入目镜供观察：

4、旋转聚焦望远镜的视力较正环，使谓焦标志双十字线清晰，然后调节显微镜粗细调焦螺旋，使标本观察清晰，井根据摄影框，移动标本，选择摄影范围。

5、将显微镜摄影机的光路选择标拔至黄档(E)，应用光电测光表进行曝光测试，测定其曝光时间。

(1)将光电信增管(EM)插入显微摄影机的镜筒内；

(2)根据胶卷的感光度调整感光度调节钮(ASASPEED)，使其与胶卷感光度相符，如胶卷感光度为GB21°，则将感光调节钮调至100ASA(与GB21°相等)。

 (3)打开测光表电源钮，使电源开关指示对着HIGH档，进行曝光测试；若光线太弱HIGH档无法测出时，再将电源开关指示对着LOW档。

(4)根据电源开关指示的位置(HIGH或LOW)和测光看指针所指位置，读出曝光时间，即为该光线强度下，进行显微摄影的曝光时间。

(5)将显微影机光路选择杆拔至绿档(CV)。

6、调整显微镜投影机曝光时间档次，使之与所测的曝光时间相符，若曝光时间在1秒以上，则将曝光时间看调至B门，曝光时间可人为控制。

 7、打开摄影机暗盒，上胶卷，按一下卷片钮，旋转眷片钮，上好胶卷，关上暗盒，再按一下卷片钮，旋转卷片钮到位．

 8、上快门，按快门线，胶卷曝光。

(二)彩色胶卷的垦微摄影操作步骤

 1—4步骤与黑白胶卷显微摄影操作步骤相同；

 5、将显微镜摄影机的光路选择杆拔至黄档(E)应用光电测光看进行色温测试，测定出与彩色胶卷色温相适应的色温来。

 (1)将光借倍增(CT)插入显微摄影机的镜筒内。

 (2)根据胶卷的色温调整曝光表的色温钮，使其与胶卷的色温相符，如胶卷色温为日光型，则将色温钮调至D.TYPE，中央指示点，如胶卷色温为灯光型，则将色温钮谓至T.TYPE中央指示点。

(3)打开测光表电源，将电源开关旋至CT，进行色温测试，如若指针向CTR红的方向移动，则光潭韵光线色温偏低，则可调整电源电压，或加用色温滤色片LB45，使其光源色温升高，使指针回到零位：如若指针向CTR蓝的方向移动，则光源的色温过高，则可降低光源电压．或加用色温片LBD，使其光源色降低，使指针回到零单，因零位是胶卷要求的正确色温。

5、待色温调准后，再按黑白胶卷5、6、7步骤依次进行。

注意事项

1、对标本进行显微调焦时，应先将载物台移动至标本接近镜头，然后再调节调焦螺旋钮，使载物台慢慢台向下移动，使标本谓至清晰，以防损坏镜头或镜片。

2、聚焦望远镜中的双十字线和被摄标本图像一定要调节清晰。

3、测色温时使用的光电倍增管是CT，测曝光时间使用的光电倍增管是EM。

4、测色温、测曝光时间、摄影机上的光路选择杆应拔至黄档（E），照相时应拔至绿档（CV）。

5、目镜和调焦望远镜在观察后应勤盖镜头盖，以防镜头污染。

6、胶卷照完后，应先按倒片钮，再进行倒片。

三  全自动显微照相技术

 

目的要求

了解全自动显微照相的结构原理，学会显微镜摄影的操作。

材料与用具

材料：取镜片(动、植物材料)为摄影对象，135胶片：

用具：显微镜、PM--10AD型全自动式显微照相装置．

实验内容和步骤

(一)显微照相设备

(1)PM--10AD型全自动皇微照相机装置及附件。

(2)自动曝光控制装置。

(二)摄影前的准备工作

I、照相装置检查

(1)曝光体的光程转柄换处于OE绿带处；

 (2)摄影方式转换盘处于自动处AUTO；

(3)ASA感光度处于胶片感度的相应位置处；

 (4)曝光警告灯呈黄色亮点：

 (5)轻按曝按钮，快门灯亮；

(6)当快门关上时，快门灯熄灭，接着进行卷片，同时相机指示灯亮，这时听到电动机轻轻动作声。

2、上胶卷

  (1)把反卷钮上拉，打开后盖；

(2)把胶片暗盒放入暗盒室里，把反卷钮自封回到原来位置上；

(3)把胶片头拉出，插入反卷卷轴槽内

(4)胶卷片钮，直至胶片两边孔跟入齿，盖上后盖

(5)按卷片钮，使胶片计数器上出现“1”数字。

(三)操作步骤

1、35mm黑白胶片摄影法

(1)将摄影方式放在AUTO位置上；

(2)把胶片尺寸35按下；

(3)把胶片感光度钮调至胶片感光度的指数上：

(4)把胶片特性补偿盘调节在   标准位置上；

(5)确定警告灯为绿色；如为红灯闪烁，可加ND滤光片，以降低亮度；

如为红灯亮，则增加照明亮度；

(6)调节标本分布曝光补偿钮处于标准位置1上；

(7)按下曝光按钮，进行摄影；

(8)胶片照完，卷片电动器会停止；胶片用完显示灯亮，并发出警告声，取出胶卷后，警告声消除；

(9)拉起反卷轴，顺时方向旋转，使胶片退回暗盒中，胶片退完，转轴旋转就会突然变轻；

(10)打开后盖，取出胶卷；

2、35mm彩色胶片摄影方法

彩色摄影与黑白胶卷摄影顺序一样，所不同的需要对照明的色温进行调节，以适应胶片指定颜色的色温，调节灯光色温可用色温计(PM--CTR)，其步骤如

(1)标本对焦后，移动标本，把透明区移入视场内

(2)把自动曝光体拉至黄带；

(3)根据胶卷类型，调节好色温刻度盘标记；

日光型     对准    D

灯光型      对准   T

(4)调节照明电压，使数字指示器，中间黄色△1标记点亮，如上侧绿色部分点亮，则照明色温过高，如下侧红色部分点亮，则照明色温过低，可调节色温器，以达到黄色△1标记点亮：

(5)将自动曝光体光程移到CVE绿带位置；

其余操作按35mm黑白胶片摄影操作。

 

 

四  暗室技术一印相与放大

 

目的要求：

 初步学会配置显影液、定影液，印相与放大，以及正确使用暗定等基本技能。

材料与用具

    (一)材料

    2号光面印相纸；3号光面放大纸；底片：D—72显影液；常用酸性定影液。

    (三)用具：

  放大机、印相机、暗房安全灯、上光机、竹夹、冲洗盘等。

实验内容与步骤

印相与放大．以及正确使用暗室等基本技能：

   (一)做好印相与放大前的准备工作：清洗干净冲洗盆，擦净印相机上的玻璃纹，把D—72显影液原液一份与二份水稀释使用，将显影液、停影液、定影液分别倒入三个冲诜盆。

   (二)关好白灯，开虹灯(暗室安全灯)。

  (三)切割印相纸及放大纸，印相纸大小稍比底片大半公分，放大纸大小根据需要比底片大3～5倍，切好后放入暗房袋中备用。

   (四)印相

1，选好底片，放在印相箱玻璃板上，使药物面朝上，将相框放上定好位，然后将相纸的药物面朝下，与底片紧贴，盖上箱盖；

2、将曝光后的相纸，投入显影液中，进行显影，到显影适度时，立即用木夹取出，投入停影液中，稍停，取出投入定影液中，定影约15分钟，显影、定影时要经常移动相纸，使药液作用均匀。

3、将定影后相纸投入流水中漂洗半小时。

4、捞取相片，稍干后贴在上光机上光板上，压上粗布，用橡皮滚筒压滚后，接上电源、加热，待相片干后，自行脱落。

5、切割整齐，即得一张完好的相片。

(五)放大

1、选好底片．放入玻璃片夹之间，使感光药面朝下，移动相框将放大部分定好位．然后插入放大机中，压下锁紧，使底片压紧。

2、根据需要选择好镜头(50mm或75mm)，将镜推入光路中；

3、打开曝光定时稳压器，使电压调至200伏；然后打开放大机的开关钮，点亮放大机灯泡。

4、旋松锁柄钮，拉下镜头架．使镜头架下沿停在需要放大倍数的数值，如放大3倍，则停在标尺的3字上；

5、用调焦器进行谓焦，调节好光圈大小，放好放大尺板位置。

6、将红色滤光片移入光程中，确定曝光时间，将放大纸放在放大尺扳上，用尺板压边力。将定时按钮上拔，放大机灯泡熄灭．然后将滤光片偏离光程。

7、按下曝光钮，进行曝光，曝光后，将放大纸迅速投入显檄液进行显影；

以后的步骤与印相部分的2～5步骤相同．为了要使放大易于成功，最好先进行五级曝光试验，找到准确曝光时间，再进行正式放大。

 

作业

交一张印好的相片及放大相片(相背后注明曝光时间，光圈大小，姓名等。